芪丹益肺通窍颗粒对变应性鼻炎大鼠血清IL-4、IFN-γ的影响

刘慧霞 刘莉 李东棋 吴跃 田理

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是I型变态反应介导的鼻腔黏膜高反应性疾病[1]。据报道[2-3]，AR发病率影响全世界高达40%的人口，而该病在中国的发病率也高于35%，是全球范围内患病率增长迅速的呼吸道疾病。同时AR具有高复发率的特点，易出现鼻窦炎、支气管哮喘等并发症，严重影响患者的生活质量[4]。益气活血法是临床治疗AR有效方法之一，祖国医学在益气扶正方面已有文献记载，《素问》言“邪之所凑，其气必虚”、“正气存内，邪不可干”，纯中药芪丹益肺通窍颗粒是田理教授基于“肺心同治”和经方时用来治疗AR的有效内治法，前期研究表明对本病症状缓解及预防复发有显著优势[5-6]，本实验通过研究芪丹益肺通窍颗粒治疗变应性鼻炎大鼠行为学观察、脏器系数及血清白介素4(Interleukin 4，IL-4)、γ-干扰素(interferon-γ，IFN-γ)表达的影响，探讨芪丹益肺通窍颗粒在AR 大鼠中的免疫调节机制，并为该方剂的临床应用提供可靠的实验依据。

1 材料

1.1实验动物 SPF级SD大鼠32只，雌雄各半，体质量180～220g(购买于成都达硕有限公司，生产许可证号：SCXK(川)2020-030)，由SPF大小鼠维持饲料喂养(北京科澳协力饲料有限公司生产，生产许可证号：SCXK(京)2019-0003)；饮水：实验动物饮用水(纯化水)，自制。以上动物饲养于四川省食品药品检验检测院(实验单位实验动物使用许可证号：SYXK(川)2020-127)。饲养条件：饮水自由不受限制；笼舍：4只每笼饲养，雌雄分开；环境：SPF级大鼠饲养于屏障系统内，饲养房间采用12/12小时明暗交替照明，保持温度20℃～26℃，相对湿度40%～70%。

1.2药物与试剂

1.2.1药物芪丹益肺通窍颗粒，中药处方包括黄芪、白术、防风、牡丹皮、川穹、黄芩、生荆芥等11味药，均由成都中医药大学附属医院药剂科提供，并由其制备而成。以上诸药均由药剂科袁华强药师鉴定，符合国家中药的临床应用标准。取芪丹益肺通窍颗粒生药141g，加纯净水煎煮至浓度为2.8g/mL，于冰箱中冷藏保存备用。氯雷他定片(10 mg/片，海南海神同洲制药有限公司，批号:H20040797)。

1.2.2试剂 卵清白蛋白(大连美伦生物技术有限公司 批号:M0228)；氢氧化铝粉末(哈药集团生物制药有限公司生产)；IL-4 ELISA 检测试剂盒(ExCell Bio批号:22J009)；IFN-γELISA 检测试剂盒(ExCell Bio批号:BZZ1185)。

1.3仪器 电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司仪器SQPQVINTIX2102-ICN)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司ST16R型)；金属浴(Scilogex 型号：HB120-S)；低温离心机(恒诺 型号：Ministar)；酶标仪(普朗 型号：DNM9602G)；移液枪(艾斯玛特 型号：5-50μL；20-200μL；200-1000μL)。

2 方法

2.1动物造模、分组及给药 将32只SPF级SD大鼠适应性喂养3天后，雌雄各半，分别称重、标记，根据随机数字表随机分为空白对照组、AR模型组和治疗组，治疗组又分为AR+芪丹益肺通窍颗粒组与AR+氯雷他定组，各组8只。造模方法参照AR 动物模型制备规范(草案)[7]。初步致敏：除空白组外，其余3组将0.3mg的卵清蛋白与30mg的氢氧化铝粉末和1mL的生理盐水相混合，制成混合悬液腹腔注射，隔日一次，共7次。强化致敏：然后使用OVA滴鼻行局部激发，均以5%卵清蛋白局部鼻腔免疫，每只每侧50μL，1次/日。对大鼠进行最后一次鼻腔制造过敏反应30min以内，参照表1持续观察大鼠出现的症状，上述指标可叠加定量评分，分数大于5分则成功造模[8]。造模成功后，空白对照组不做处理，按照《药理实验方法学》各组药物灌胃剂量如下：中药组灌胃芪丹益肺通窍颗粒溶液(10mL/kg)，2次/日，氯雷他定AR组每日以成人临床剂量8倍的氯雷他定(0.9mg/kg)灌胃，1次/日[9-10]，模型对照组给予等量生理盐水灌胃，2次/日，连续给药14天。每次用药治疗后采用5%卵清蛋白局部鼻腔免疫每只100μL，1次/日，共14次，空白组以等量PBS缓冲液滴鼻，30min 内观察动物的行为。

表1 行为学评分标准

2.2症状学观察 观察大鼠挠鼻次数、打喷嚏次数等并记录评分。

2.3样本采集 于第14次治疗24小时后，用戊巴比妥钠麻醉大鼠后处死，取腹主动脉血保存备用。

2.4ELISA检测血清 IL-4及IFN-γ的含量 采用ELISA试剂盒检测血清中的 IL-4、IFN-γ等细胞因子浓度，单位用Ku/L 表示。

3 结果

3.1芪丹益肺通窍颗粒对AR大鼠鼻部症状观察(见表2)。

与空白对照组比较，激发第1天、7天模型对照组大鼠鼻部症状评分升高(P<0.05)；与模型对照组同期比较，芪丹益肺通窍颗粒组及氯雷他定组给药7、14 天评分均下降(P<0.05)。

表2 不同组间大鼠鼻部症状评分(分，

表3 不同组间大鼠的各种脏器系数(%)比较

3.3对AR大鼠血清IL-4和IFN-γ水平的影响(见表4) 与空白对照组比较，模型组大鼠血清中IL-4水平明显升高、IFN-γ水平降低均(P<0.05)；与模型组比较，芪丹益肺颗粒组和氯雷他定组大鼠血清中IL-4水平降低、IFN-γ水平升高(均P<0.05)，但2个治疗组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 不同组间大鼠血清IL-4、IFN-γ比较

4 讨论

变应性鼻炎是I型变态反应介导的鼻腔黏膜高反应性疾病[1]，以突然和反复发作的喷嚏、鼻塞、清水样涕、鼻痒为主要表现。目前普遍认为其发病机制是过敏原作用于机体，导致Th1/Th2失衡而引发的以鼻腔黏膜Th2免疫反应为主的炎性反应[11，13]。活化后的Th2细胞分泌的介质IL-4，促进体液免疫反应，IL-4是重要的促炎因子[12]，Th1细胞分泌的IFN-γ，可抑制Th2细胞的分化和功能，介导细胞免疫反应。

鼻鼽的发生与肺心两脏密切相关[14]，古籍云“五气入鼻，藏于心肺，心肺有病，而鼻为不利也”，心主血脉，肺主气，气为血之帅，血为气之母，心肺发挥气血运化功能，使鼻窍通利，若气虚则血液运行无力、流动受阻，最终形成血瘀，血瘀与气虚、气滞常伴随。田老[14-17]认为，鼻鼽发病多以气虚为本，血瘀为标，因气虚起病，因血瘀难愈，“气虚血瘀，窍络瘀阻”乃此病基本病机，治以肺心同治，益气活血通窍，经方时用，由玉屏风散加味而成芪丹益肺通窍颗粒来治疗效果佳。

芪丹益肺通窍颗粒以黄芪为君药，白术、防风、川芎为臣药，君药黄芪，甘，微温；归脾、肺经，有健脾补肺、益卫固表，补气升阳，利水消肿之功，为补气之圣药，而甘温之性，补益肺脾之气佳[18-19]。现代研究[20]表明，黄芪含有黄酮类、皂苷类、多糖类等多种有效成分，具有调节免疫、抗癌、抗病毒、神经保护、降糖，等诸多药理学活性。徐江涛[21]等通过黄芪多糖对肺气虚型AR大鼠模型影响的研究，得出黄芪多糖可能通过下调 TSLP、OX40L mRNA表达，抑制Th2细胞分化信号，减轻变应性鼻炎中Th2炎症反应，缓解AR大鼠鼻黏膜炎性症状。髓源性抑制细胞在自身免疫性疾病等过程中发挥重要的作用。报道[22-24]显示黄芪多糖可以降低宫颈癌、肺癌患者及荷瘤鼠脾脏中髓源性抑制细胞(MDSCs)水平，提高机体免疫功能。臣药白术，味甘、苦，性温， 归脾、胃经，具有燥湿利水、补脾健胃、止汗、安胎等功效，主治脾虚泄泻、食少肚胀、倦怠乏力、胎动不安等病症[25]，为“脾脏补气健脾第一要药”。白术的主要化学成分[26]为挥发油、内酯及多糖，白术多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖及免疫调节等多种生物活性 。报道称[25]，白术多糖可能对脾淋巴细胞培养体系中的 T、B 淋巴细胞具有选择性作用，能促进 ConA 诱导的脾淋巴细胞转化，但对 LPS 刺激的脾淋巴细胞转化具有抑制作用。防风味辛、微甘，性温，主归膀胱、肝、脾经，具有解表祛风、胜湿之功效[27]。研究发现防风具有免疫调节、镇痛、抗炎等作用[28]。臣药川芎，味辛、温，入心包经，是活血行气的良药。川芎嗪是从川芎中提取的生物碱类有效成分，研究发现[29-30]，其有保护内皮细胞、抗炎、抗氧化应激、抗血小板活化等作用。君药黄芪与臣药白术配伍对减缓气道重塑进展有积极作用[31-32]，且该药对补益肺脾之气较单味药的力量更强，效果更好[33]，可通过IL1β而发挥调控炎症反应、氧化应激反应、血管新生治疗COPD[34]。

本研究显示，模型组大鼠较正常大鼠血清中IL-4水平明显升高、IFN-γ水平降低均(P<0.05)；与模型组比较，芪丹益肺颗粒组和氯雷他定组证候表现明显改善，鼻部症状评分降低，血清中IL-4水平降低、IFN-γ水平升高(均P<0.05)，但2个治疗组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明芪丹益肺通窍颗粒可有效控制AR大鼠鼻痒、喷嚏等症状，其机制可能是下调IL-4水平与上升IFN-γ水平来纠正Th1/Th2失衡而对变应性鼻炎大鼠发挥治疗作用，本研究为运用益气活血通窍法治疗变应性鼻炎提供了实验依据。