青叶苎麻叶多酚超声辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究

张晓婷 王满生 邱浩楠 叶凤凌 职士淇 陈 龙 何 强 王延周 董 怡

(1. 四川大学轻工科学与工程学院，四川 成都 610065；2. 中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205；3. 农业部麻类生物学与加工重点实验室，湖南 长沙 410205)

多酚是植物生长发育过程中重要的次生代谢产物，广泛存在于植物茎叶等组织中。研究[1-4]表明，多酚除具有抗氧化的生物活性作用外，还表现出良好的抑菌、抗炎、抗病毒、防癌抗癌、抑制肿瘤、防治心血管疾病等方面活性作用。

苎麻是一种多年生宿根性草本植物，一年可收获多次，且叶片约占植株质量的40%，是苎麻营养生长过程中生物产量最大的组织。苎麻叶富含琥珀酸、原儿茶酸等酚类物质，具有较高的食品保健和药用开发价值[5]。与传统的白叶苎麻相比，青叶苎麻因叶背面无白色绒毛，极易被打碎和过筛，使其粉碎性能大大提高[6]。另外，青叶苎麻蛋白质含量较高，且氨基酸含量在苎麻近缘植物中含量最为丰富[7]。因此，目前青叶苎麻主要用于调制加工成动物饲料[8-11]，也有将叶片提取物尝试用于药物开发[12]，但在食品加工领域除了涉及叶片蛋白质的提取[6, 13]外，有关叶片多酚类物质及其活性的研究还未见报道。

目前多酚提取多采用水和甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂[14-15]，提取方法多为超声辅助提取[16]、微波辅助提取[17]、超临界流体提取[18-19]、加压溶剂提取[20]和酶法辅助[21]等。有研究[22]表明，超声波辅助提取过程会产生空化效应、机械效应和热效应等，且多级效应结合又产生高剪切力，产生微射流，加速细胞壁破碎速度，增加溶剂渗透作用，提高传质效率，缩短提取时间，能有效提高多酚提取率。因此，试验拟采用超声辅助乙醇法提取青叶苎麻叶中的多酚物质，优化其提取工艺条件，并研究其抗氧化活性，以期为青叶苎麻叶多酚的深入研究和青叶苎麻资源的拓展利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青叶苎麻叶粉：过60目筛，中国农业科学院麻类研究所；

无水碳酸钠、无水乙醇、过硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：分析纯，成都金山化学试剂有限公司；

没食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：色谱纯，上海源叶生物公司；

福林酚：分析纯，成都市科隆化学品有限公司；

水溶性维生素E(Trolox)、荧光素钠、2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(AAPH)：色谱纯，西格玛奥德里奇贸易有限公司；

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；

电子天平：EAJ210-4A型，沈阳龙腾电子有限公司；

三频数控超声波清洗器：KQ-300VDE型，昆山市超声仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-6000PC型，上海元析仪器有限公司；

电子恒温水浴锅：DWKW-4型，北京中兴伟业仪器有限公司；

多功能微孔板检测仪：Synergy H1型，美国伯腾仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 没食子酸标准曲线的绘制 以没食子酸为标准品，采用福林酚法测定青叶苎麻叶提取液中总多酚含量。准确称取20.0 mg没食子酸标准品(纯度≥99.0%)，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，制得200 mg/L没食子酸标准储备液，于4 ℃冰箱中避光保存。准确吸取没食子酸标准储备液0.0，0.2，0.4，0.6，1.0，1.5 mL分别置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶液定容至刻度，得到没食子酸工作液。于10 mL比色管中分别加入没食子酸工作液1.0 mL，福林酚试剂0.5 mL，摇匀后加入15%的Na2CO3溶液1.5 mL，加水定容至刻度，摇匀后于40 ℃水浴静置2 h，自来水冷却后测定其在760 nm条件下的吸光度值。所得结果以吸光值为纵坐标(Y)，没食子酸质量浓度(X)为横坐标，绘制出没食子酸标准曲线(见图1)，求得回归方程为Y=0.010 1X+0.057 4，R2=0.994 4。

图1 没食子酸标准曲线Figure 1 Standard curve of gallic acid

1.2.2 青叶苎麻叶中多酚的提取 准确称取0.5 g苎麻样品若干份(每3份为一组平行试验)，按照一定的料液比添加一定量的一定浓度乙醇溶液，在一定条件下超声提取，静置冷却后在25 ℃、6 000 r/min条件下离心30 min，取上清液备用。准确吸取1.0 mL提取液(或根据实际需要按一定比例稀释后再取用)，于10 mL比色管中，按1.2.1建立没食子酸标准曲线的方法测定提取液中总酚含量，再根据标准曲线计算待测液中总多酚浓度。

1.2.3 青叶苎麻叶多酚提取的单因素试验

(1) 料液比：固定提取温度25 ℃、超声功率300 W、超声时间5 min、乙醇体积分数60%，分别测定料液比(m苎麻∶V乙醇)为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL) 时的多酚提取量，确定合适的料液比。

(2) 乙醇体积分数：根据优化出的料液比，固定提取温度25 ℃、超声功率300 W、超声时间5 min，分别测定乙醇体积分数为0%，20%，40%，60%，100%时的多酚提取量，确定合适的乙醇体积分数。

(3) 提取温度：根据优化出的料液比和乙醇体积分数，固定超声功率300 W、超声时间5 min，分别测定超声温度为25，35，40，45，55 ℃时的多酚提取量，确定合适的提取温度。

(4) 超声功率：根据优化出的料液比、乙醇体积分数和提取温度，固定超声时间为5 min，分别测定超声功率为120，180，240，300 W时的多酚提取量，确定合适的超声功率。

(5) 超声时间：根据优化出的料液比、乙醇体积分数、提取温度和超声功率，分别测定超声时间为5，10，15，20 min 时的多酚提取量，确定合适的超声时间。

1.2.4 多酚提取工艺响应面优化试验 在单因素试验基础上，选出对其影响较大的因素，以多酚提取量为评价指标，利用Box-Benhnken进行响应面试验设计，运用Design-Expert 8.0.6软件分析试验结果，优化青叶苎麻多酚超声辅助提取工艺条件。

1.2.5 青叶苎麻叶多酚抗氧化活性评价 在最佳提取工艺条件下，提取青叶苎麻叶中的多酚，并分别从清除DPPH自由基能力、清除ABTS+自由基能力和氧自由基吸收能力(ORAC法)3个方面评价青叶苎麻叶中多酚的抗氧化活性。

(1) DPPH自由基清除能力：参照贺银菊等[23]的方法，以IC50值对比青叶苎麻叶多酚提取溶液和没食子酸清除DPPH自由基的能力。按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

QD——DPPH自由基清除能力，%；

A0——空白组吸光度值(0.5 mL样品溶剂+0.5 mL的DPPH溶液)；

Ai——样品组吸光度值(0.5 mL样品溶液+0.5 mL的DPPH溶液)；

Aj——对照组吸光度值(0.5 mL样品溶液+0.5 mL的DPPH乙醇溶液)。

(2) ABTS+自由基清除能力：参照蔡如玉等[24]的方法，以IC50值对比青叶苎麻叶多酚提取溶液和没食子酸清除ABTS+自由基的能力。按式(2)计算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

QA——ABTS+自由基清除能力，%；

A0——空白组吸光度值(50 μL样品溶剂+950 μL ABTS+自由基稀释溶液)；

Ai——样品组吸光度值(50 μL样品溶液+950 μL ABTS+自由基稀释溶液)；

Aj——对照组吸光度值(50 μL样品溶液+950 μL ABTS+自由基稀释溶剂)。

(3) 氧自由基吸收能力(ORAC法)：参照余欣珂等[25]和董怡[26]的方法，以水溶性维生素E(Trolox)当量值(g Trolox/g多酚)对比浓度为425.3 μg/L没食子酸和总酚浓度为50 μg/L的青叶苎麻叶多酚提取液的氧自由基吸收能力。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

如图2所示，优化出的料液比(m苎麻∶V乙醇)为1∶

图2 青叶苎麻叶多酚提取单因素试验结果Figure 2 Single factor experimental results of polyphenols extraction from leaves of green leaves ramie

40 (g/mL)、乙醇体积分数为40%、提取温度为40 ℃、超声功率为180 W、超声时间为5 min。

2.2 响应面优化青叶苎麻多酚提取工艺

2.2.1 响应面模型建立及分析 根据单因素试验结果，筛选出对多酚提取量影响较大的三因素分别为：料液比、乙醇体积分数和提取温度为优化因素，因此后续将固定超声功率和超声时间分别为180 W和5 min进行响应面优化试验，试验设计的编码水平见表1，试验结果见表2。

表1 响应面试验水平因素Table 1 Response surface test level factors

利用Design Expert 8.0.6软件对表2的试验数据进行二次多项式回归拟合，得到料液比、乙醇体积分数、提取温度与青叶苎麻多酚提取量(Y)的二次回归模型为：

表2 响应面分析方案及结果Table 2 Response surface analysis scheme and results

Y=47.74-0.018A+0.37B+0.66C-1.43AB-0.60AC+0.64BC-1.94A2-3.87B2-1.40C2。

(3)

表3 回归方程方差分析†Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.2.2 响应面优化分析 由图3可知，3个响应面的3D图中部凸起，说明青叶苎麻多酚提取量(响应值)存在最大值。超声温度的变化曲面较为陡峭，料液比、乙醇体积分数的变化曲面相较于温度略显平稳，表明温度对青叶苎麻多酚提取量的影响更为显著，且等高线图均为明显的卵圆形，表明料液比、乙醇体积分数、超声温度之间有较为显著的交互作用，对于青叶苎麻多酚提取量影响较大。

图3 各因素交互作用对多酚提取量影响的响应面和等高线图Figure 3 Response surface and contour map of the influence of interaction of various factors on polyphenol extraction amount

根据所建立的响应面模型对青叶苎麻多酚提取量进行工艺参数最优化分析，得到青叶苎麻多酚提取最佳工艺参数条件为料液比(m苎麻∶V乙醇)1∶33 (g/mL)、乙醇体积分数40.84%、提取温度41.36 ℃，在此条件下青叶苎麻多酚提取量可以达到47.84 mg/g。根据优化结果，选择青叶苎麻多酚提取参数条件为料液比(m苎麻∶V乙醇)1∶33 (g/mL)、乙醇体积分数40%、提取温度42 ℃，进行3次平行验证实验，结果显示青叶苎麻叶多酚提取量为47.97 mg/g，与理论值非常接近，说明该模型预测可信。

2.3 多酚抗氧化活性评价

与以没食子酸为对照，青叶苎麻叶多酚提取物清除DPPH自由基能力、清除ABTS自由基能力和氧自由基吸收能力(ORAC值)如表4所示。

2.3.1 DPPH自由基清除能力 没食子酸和青叶苎麻叶中的多酚均具有一定的清除DPPH自由基的能力。由表4 可知，青叶苎麻多酚溶液清除DPPH自由基的IC50值小于没食子酸溶液的，说明青叶苎麻多酚溶液对DPPH自由基的清除能力极显著强于没食子酸溶液(P<0.01)。

表4 青叶苎麻多酚抗氧化活性评价†Table 4 Evaluation of antioxidant activity of polyphenols from leaves of green leaves ramie

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 没食子酸和青叶苎麻叶中的多酚都具有一定的清除ABTS+自由基的能力。

由表4可知，青叶苎麻多酚溶液清除ABTS+自由基的IC50值小于没食子酸溶液的，说明青叶苎麻多酚溶液对ABTS+自由基的清除能力极显著强于没食子酸溶液(P<0.01)。

2.3.3 氧自由基吸收能力(ORAC法) Trolox溶液标准曲线如图4所示。建立标准曲线方程为y=0.615 9x+26.504(R2=0.999 4)。根据曲线方程，计算得到青叶苎麻叶多酚提取物与标准对照没食子酸的氧自由基吸收能力。由表4可知，青叶苎麻多酚的氧自由基吸收能力明显强于没食子酸，且优势极显著(P<0.01)。

图4 Trolox溶液标准曲线Figuer 4 Standard curve of Trolox solution

多酚提取液中含有多种酚类物质，各种酚类物质通过拮抗、协同或叠加等效应，影响提取液的生理活性[27-29]。这也可能是青叶苎麻叶多酚提取物表现出优于没食子酸的抗氧化性的原因。此外，多酚提取液生理活性还与其中多酚类物质的含量显著相关。

3 结论

在超声波辅助提取青叶苎麻叶多酚中，料液比、乙醇体积分数、超声温度、超声时间、超声功率对多酚提取量都有不同程度的影响，其中料液比、超声温度、超声时间的影响较大。响应面优化后的提取条件为：料液比(m苎麻∶V乙醇)1∶33 (g/mL)、乙醇体积分数40%、提取温度42 ℃，超声功率180 W、超声时间5 min，在此条件下青叶苎麻多酚提取量为47.97 mg/g。青叶苎麻叶多酚提取物具有较强的抗氧化活性，对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力，以及氧自由基吸收能力均强于没食子酸。后期将针对其中多酚组成及各组分对其抗氧化性的贡献作用进行深入分析。