基于Wnt/β-catenin信号通路探讨VEGF基因转染骨髓源内皮祖细胞移植治疗大鼠缺血皮瓣的实验

殷杰 赵胜利 蔡晓明 袁辉宗 李俊杰 竺枫

[摘要] 目的 分析基于無翅型MMTV整合位点家族（Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路，血管内皮生长因子（VEGF）基因转染骨髓源内皮祖细胞（EPCs）移植对大鼠缺血皮瓣的治疗作用。 方法 培养诱导分化大鼠EPCs，脂质体介导VEGF转染EPCs。Wistar大鼠制备缺血皮瓣模型分为对照组、VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、Wnt/β-catenin信号通路激活剂氯化锂（LiCl）组。VEGF-EPCs组与NC-EPCs组皮瓣分别注射PcDNA3.1（+）/VEGF165质粒、PcDNA3.1（+）/NC空载对照质粒，对照组注射PBS溶液，LiCl组注射LiCl。酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清VEGF水平;观察大鼠皮瓣存活情况;激光多普勒血液检测仪检测皮瓣蒂部血流;HE染色计算皮瓣毛细血管密度;Western blotting检测皮瓣组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。 结果 镜下观察分离培养的EPCs外观呈“铺路石”状，经鉴定符合EPCs表面抗原。VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组血清VEGF水平、皮瓣存活率、PU值、毛细血管密度高于对照组，且VEGF-EPCs组高于NC-EPCs组、LiCl组，差异有统计学意义（P<0.05），NC-EPCs组与LiCl组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组β-catenin、c-myc蛋白相对表达量高于对照组，LiCl组高于VEGF-EPCs组与NC-EPCs组，VEGF-EPCs组高于NC-EPCs组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 VEGF基因转染骨髓源EPCs移植能促进大鼠缺血皮瓣的存活，改善血液循环，增加微血管密度，其机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

[关键词] 血管内皮生长因子;皮瓣移植;无翅型MMTV整合位点家族;β-连环蛋白;内皮祖细胞

[中图分类号] R622          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）31-0036-05

[Abstract] Objective To analyze the therapeutic effects of vascular endothelial growth factor （VEGF） gene transfection of bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs） transplantation on ischemic flaps in rats based on the wingless-type mouse mammary tumor virus （MMTV） integration site family （Wnt）/β-catenin signaling pathway. Methods The rat EPCs were cultured and induced to differentiate， and the EPCs were transfected with liposome-mediated VEGF. The Wistar rats were divided into control， VEGF-EPCs， negative control （NC）-EPCs and Wnt/β-catenin signaling pathway activator lithium chloride（LiCl） groups to prepare the ischemic flap models. These Wistar rats in the VEGF-EPCs group， NC-EPCs group， control group and LiCl group were respectively injected with PcDNA3.1（+）/VEGF165 plasmid， PcDNA3.1（+）/NC empty control plasmid， phosphate buffer saline （PBS） solution and LiCl into the skin flaps. Serum VEGF levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， the survival of rat flaps was observed， blood flow at the tip of the flap was measured by laser Doppler blood detector， HE staining was performed to calculate the capillary density of flap， and Western blotting was adopted to detect the expression of proteins related to Wnt/β-catenin signaling pathway in flap tissue. Results The appearance of EPCs was “paving stone” under microscope， which was identified as meeting the surface antigen of EPCs. Serum VEGF levels， flap survival rate， PU value， and capillary density in the VEGF-EPCs group， NC-EPCs group， and LiCl group were higher than those of the control group， and those of the VEGF-EPCs group were higher than those of the NC-EPCs group and LiCl group，the difference was statistically significant（P<0.05）. However，there were no significant differences between the NC-EPCs group and the LiCl group in the above-mentioned indices （P>0.05）. The relative expression of β-catenin and c-myc protein in the VEGF-EPCs group， NC-EPCs group and LiCl group was higher than that in the control group. Meanwhile，the relative expression of β-catenin and c-myc protein in the LiCl group was higher than that in the VEGF-EPCs group and NC-EPCs group， and that in the VEGF-EPCs group was higher than that in the NC-EPCs group，the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion VEGF gene transfection of bone marrow-derived EPCs transplantation can promote the survival of ischemic flaps， improve blood circulation and increase microvascular density in rats， and the mechanism is related to the activation of Wnt/β-catenin signaling pathway.

[Key words] Vascular endothelial growth factor; Flap transplantation; Wingless-type MMTV integration site family; β-catenin; Endothelial progenitor cells

皮瓣移植是治疗软组织缺损的有效方式，在肌腱、大血管、神经干、关节、骨等组织裸露的新鲜创面/陈旧性创伤和器官再造中均有应用[1]。移植部位皮瓣血管的新生与血运重建是影响皮瓣存活的关键，干细胞治疗技术的发展，为血运重建的治疗研究提供了新的方向[2]。血管内皮组细胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）作为血管内皮细胞的前体细胞，能在一定的生理或病理条件刺激下，从骨髓动员至外周血，参与损伤血管的修复与再生[3]。研究证实[4]，缺血肢体中植入EPCs，可改善血运，证实了EPCs移植治疗的可行性。但在糖尿病、老年人及高胆固醇血症人群中，因血液循环中EPCs少，应用有限。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）是调控EPCs向内皮分化的重要细胞因子，在促进EPCs的分裂、增殖、迁移与血管构建方面有强大的调控作用[5]。故本研究探讨VEGF基因转染骨髓源EPCs移植对缺血皮瓣大鼠模型的治疗情况及无翅型MMTV整合位点家族（Wingless-type MMTV integration site family，Wnt）/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路在其中的调控作用，以期为皮瓣移植及相关缺血性疾病的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，45只，4周龄，体重60～90 g，购自广州赛业百沐生物科技有限公司，许可证号SCXK（粤）2020-0055。任选40只大鼠随机分为对照组、VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、Wnt/β-catenin信号通路激活剂氯化锂（LiCl）组，每组10只。

1.2 药物、试剂与仪器

PcDNA3.1（+）/VEGF165质粒、PcDNA3.1（+）/NC空载对照质粒（上海生工生物工程有限公司构建合成），LiCl（含量≥98%，美国HARVEY公司），兔抗鼠CD34+、CD133+、血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2+）、β-catenin、反式激活活性蛋白（cell-myc，c-myc）一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（德国默克公司），脂质体转染试剂LipofectamineTM2000[贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司]，酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）VEGF试剂盒（上海广锐生物科技有限公司），CheniDoc XRS化学发光成像分析系统（美国Bio-rad公司），PeriFlux 5000激光多普勒血液检测仪（帕瑞医学科技有限公司），M500荧光显微镜（赛默飞世尔科技中国有限公司），Attune NxT流式细胞仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 EPCs分离培养及鉴定  任选5只Wistar大鼠，2%戊巴比妥钠过量麻醉处死（100 mg/kg），75%酒精浸泡10 min，于无菌工作台取四肢长骨，放置于含有10 mL PBS的平皿中，剪骨刀沿长骨中间剪开，PBS溶液冲洗骨髓腔，获得骨髓细胞反复吹打均匀，250目滤网过滤，1000 r/min离心5 min，收集底部细胞，加入Histopaque-1083细胞分离液，2000 r/min离心30 min，吸取第二层单核细胞，PBS清洗、吹打混匀，1000 r/min离心10 min，弃上清，调整细胞浓度为107/mL接种于铺有纤维连接蛋白的塑料培养皿中，37℃，5%CO2环境培养箱中培养，每3～4 天换液1次，待细胞生长融合至80%时，以0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸二钠消化，1∶2比例传代分瓶。取第2代晚期EPCs，胰酶消化后PBS重悬，调整细胞密度为1×106个/mL，分成每管100 μL，加入CD34+、CD133+、VEGFR-2+兔抗鼠单克隆抗体，室温避光孵育30 min，PBS洗涤后重悬细胞，以流式细胞技术鉴定细胞免疫表型。

1.3.2 PcDNA3.1（+）/VEGF165體外转染EPCs  培养第7 天，细胞融合率达到70%左右，EPCs以1.0×107/L密度接种于24孔板中，每孔5个复孔，分别设为对照组、VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组，其中VEGF-EPCs组与NC-EPCs组严格按照Lipofectamine TM2000脂质体法转染说明书要求转染PcDNA3.1（+）/VEGF 165质粒、PcDNA3.1（+）/NC空载对照质粒，对照组不转染任何质粒，LiCl组加入40 μM的LiCl。

1.3.3 缺血皮瓣制备及细胞移植  根据参考文献[6-7]制备缺血皮瓣模型，2%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，取俯卧位固定，备皮消毒，于背部设计蒂部位于双侧髂棘连线上的随意型超比例皮瓣，造成远端部分组织缺血，大小约为2 cm×8 cm，沿标记线切开皮瓣四边达深筋膜。在皮瓣形成后分别于距离皮瓣蒂部4.5、6、7.5 cm，距皮瓣边缘各1 cm的深筋膜层选择6个对称注射部位点，VEGF-EPCs组注射含有5×105个VEGF-EPCs的PBS 500 μL，NC-EPCs组注射5×105个NC-EPCs的PBS 500 μL，对照组仅予以注射PBS 500 μL，LiCl组注射含有LiCl的PBS 500 μL，注射后以3-0尼龙线将皮瓣原位缝合，分笼饲养，于术后4 d断蒂。

1.3.4 ELISA检测血清VEGF水平  于断蒂后7 d（皮瓣术后11 d）后抽取尾静脉血，离心分离上层血清，保存于-20℃环境，按照ELISA试剂盒说明书检测VEGF水平，以酶标仪读取450 nm处吸光度值，根据标准曲线计算各组VEGF水平。

1.3.5 皮瓣存活率、皮瓣供血及毛细血管密度检测  尾静脉抽血后麻醉固定大鼠，背部皮瓣拍照，以Image-Pro Plus软件分析皮瓣存活率。皮瓣存活率=（皮瓣总面积-皮瓣坏死面积）/皮瓣总面积×100%，皮瓣坏死判断标准：颜色发黑、质地较硬，有组织回缩表现，或有坏死创面形成。以激光多普勒血液检测仪检测皮瓣蒂部血流灌注，记录PU值（灌注单位）。PU值检测后切取皮瓣标本，10%中性甲醛固定，酒精梯度脱水，常规石蜡包埋，制作4 μm厚度切片，HE染色，中性树胶封片，随机选5个视野，计算视野中毛细血管密度（血管断面数目/面积）。

1.3.6 Western blotting检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达情况  剩余皮瓣液氮中研磨，Trizol试剂盒提取总RNA，逆转录获得cDNA，细胞裂解液裂解后，离心取上层清液，BCA试剂盒鉴定蛋白总量，取适量蛋白样品加入等体积上样缓冲液，100℃水浴加热5 min使蛋白变性，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，转膜，37℃、5%脱脂奶粉封闭孵育1 h，加入β-catenin（1∶500）、c-myc（1∶800）一抗稀释液，4℃孵育过夜，加入二抗稀释液（1∶2000），常规孵育30 min，ECL显影、定影，凝胶成像系统扫描分析灰度值析，以目的蛋白与GAPDH内参灰度值比值表示目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件分析处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPCs形态观察及鉴定

分选后的细胞24 h内贴壁生长，形态为圆形或类圆形，培养第3～10 天可见EPCs克隆，集落中心细胞密度较高，细胞呈梭形、三角形或多边形;传代后3 d低倍镜下见细胞呈“铺路石”样外观（封三图3）。流式细胞仪鉴定晚期EPCs表达CD34+、CD133+、VEGFR-2+，阳性细胞比率分别为（13.52±1.23）%、（1.23±0.23）%、（38.58±4.36），符合EPCs表面抗原。

2.2 各组大鼠血清VEGF水平比较

各组大鼠血清VEGF水平比较，差異有统计学意义（P<0.001）;与对照组比较，VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组血清VEGF水平更高（P<0.05）;与VEGF-EPCs组比较，NC-EPCs组与LiCl组血清VEGF水平更低（P<0.05）;NC-EPCs组与LiCl组血清VEGF水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠皮瓣存活率、PU值及毛细血管密度比较

各组大鼠皮瓣存活率、PU值、毛细血管密度比较，差异有统计学意义（P<0.001）;与对照组比较，VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组大鼠皮瓣存活率、PU值及毛细血管密度更高（P<0.05）;与VEGF-EPCs组比较，NC-EPCs组与LiCl组皮瓣存活率、PU值及毛细血管密度更低（P<0.05）;NC-EPCs组与LiCl组皮瓣存活率、PU值及毛细血管密度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠皮瓣组织β-catenin、c-myc蛋白表达比较

各组大鼠皮瓣组织β-catenin、c-myc蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.001）;与对照组比较，VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组的β-catenin、c-myc蛋白相对表达量更高（P<0.05）;与VEGF-EPCs组比较，NC-EPCs组β-catenin、c-myc蛋白相对表达量更低，LiCl组β-catenin、c-myc蛋白相对表达量更高（P<0.05）;与NC-EPCs组比较，LiCl组β-catenin、c-myc蛋白对表达量更高（P<0.05）。见表3、图1。

3 讨论

近年来，随着社会生活节奏的加快，车祸、重物砸伤引起的软组织缺损及各种心血管并发症造成的器官及肢体远端缺血病例增加，常规保守治疗难以达到满意的效果，需皮瓣移植治疗[8]。及时的血运重建是皮瓣移植再植存活的基本条件，血管的新生是再植皮瓣血运重建的关键，涉及血管形成和血管生成两种机制[9]。EPCs移植是目前治疗性血管生成技术的重要研究内容，而VEGF作为调控EPCs分化的细胞因子，在促进血管形成方面有重要作用。本研究通过验证VEGF基因体外转染骨髓源EPCs移植治疗缺血皮瓣大鼠模型，观察其皮瓣存活情况，并探讨相关机制，旨在为组织及器官缺血的研究提供参考。

利用组织工程与基因技术促进血管新生的细胞因子植入损伤部位，以促进局部血管再生和血运重建，达到组织修复的目的是皮瓣移植治疗的目的。EPCs是近年来干细胞治疗技术中研究较多的细胞类型，具有多向分化潜能，在骨髓、胚胎组织、脂肪组织及脐带血中广泛存在，其中骨髓中的含量最为丰富，增殖能力更强且获取方便[10-11]。EPCs在组织缺血时能从骨髓中动员迁移至缺血部位，分化为成熟的内皮细胞，促进新生血管的形成，且被证实对于促进慢性伤口组织再生有极大的潜能[12-13]。虽然以EPCs为主的干细胞治疗技术具有多种优势，但在老年人、糖尿病等骨髓造血能力较弱人群中，其循环中的EPCs缺乏，无法满足治疗需要，如何使能力有限的EPCs获得更好的促血管生成作用成为学者们的研究重点。VEGF是一种糖基化分泌性多肽因子，可由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、骨骼肌细胞及成纤维细胞分泌，参与胚胎时期的心血管系统形成，促进内皮细胞的增殖、迁移，增加血管的通透性并能调整血管密度，其中VEGF165是其主要表型[14-15]。本研究中通过脂质体介导，将VEGF165基因转染至诱导分化成功的EPCs，注射于大鼠缺血皮瓣，结果VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组血清VEGF水平、皮瓣存活率、PU值、毛细血管密度高于对照组，且VEGF-EPCs组高于NC-EPCs组、LiCl组，NC-EPCs组与LiCl组比较，差异无统计学意义（P>0.05），说明VEGF基因转染骨髓源EPCs移植与Wnt/β-catenin信号通路的激活均可促进大鼠缺血皮瓣血管形成和血管生成，更利于缺血皮瓣的存活。

Wnt/β-catenin信号通路是生物体进化过程中高度保守的通路，在调控细胞的增殖、生长、分化、维持细胞内环境稳定中有重要作用，参与缺血周边组织血管的新生[16]。研究发現[17]，多功能干细胞向内皮细胞分化依赖于β-catenin介导的Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的关键调控蛋白，在无小分子Wnt配体的情况下，胞质内β-catenin被磷酸化降解，导致细胞质内游离的β-catenin水平下降，在缺血缺氧条件下机体受Wnt信号刺激，Wnt/β-catenin通路被激活，促进散乱蛋白磷酸化，抑制β-catenin的磷酸化，使非磷酸化的β-catenin在细胞质内堆积易位进入细胞核，促进其下游靶基因c-mys的表达[18]。研究发现[19]，Wnt/β-catenin能与VEGF基因启动子中TCF位点结合，参与VEGF基因的转录、调控。Jiang等[20]发现，在小鼠四肢缺血模型中通过破坏β-catenin与细胞因子之间的相互作用，可抑制缺血性损伤后的血管生成，并损害Wnt/β-catenin信号的传导。本研究结果中VEGF-EPCs组、NC-EPCs组、LiCl组β-catenin、c-myc蛋白相对表达量高于对照组，LiCl组高于VEGF-EPCs组与NC-EPCs组，VEGF-EPCs组高于NC-EPCs组，说明VEGF基因转染骨髓源EPCs能提高缺血皮瓣组织中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达。

综上所述，VEGF基因转骨髓源EPCs移植治疗大鼠缺血皮瓣能促进皮瓣存活，改善皮瓣供血，促进毛细血管的生成，其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。可考虑将VEGF基因转染骨髓源移植作为皮瓣移植治疗的研究方向。

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（收稿日期：2021-03-04）