山羊ADCY1和CYM基因多态性及其与产羔数关联分析

李昆谕 洪琼花 陶林 江炎庭 欧阳依娜 储明星 刘玉芳

摘要 [目的]分析腺苷酸環化酶1（ADCY1）和胰凝乳蛋白酶（CYM）基因单核苷酸多态性（SNPs）与山羊产羔性状的关联。[方法]通过 MassARRAYSNP分型技术对ADCY1和CYM基因SNPs位点进行分型，检测其在云上黑山羊（n=544）、济宁青山羊（n=133）和辽宁绒山羊（n=91）3个群体中的遗传学特征，并将其多态性与产羔性能（产羔数、初生窝重、断奶窝重）进行关联分析。[结果]群体遗传学结果表明，ADCY1基因4个突变在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊中均为低度多态（PIC≤0.25）;CYM基因g.87624254G>A和g.87627082G>A 2个位点在3种山羊中均为中度多态（0.25<PIC<0.50）;卡方检验显示，除ADCY1 g.43996583C>T在辽宁绒山羊中处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05），ADCY1基因其余位点和CYM基因g.87624269 G>A、g.87627082G>A 2个位点在3个群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。关联分析结果表明，在云上黑山羊中ADCY1基因g.43979904G>A、g.43974472G>A，CYM基因g.87624254G>A位点多态性与产羔数存在显著关联（P<0.05）;ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T，CYM基因g.87624254G>A、g.87627082G>A位点多态性与初生窝重存在显著关联（P<0.05）。[结论]ADCY1基因g.43974472G>A和g.43979904G>A位点可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T位点，CYM基因g.87627082G>A位点可作为云上黑山羊初生窝重选择的潜在分子标记;CYM基因g.87624254G>A位点可作为云上黑山羊窝重选择的潜在分子标记。

关键词 山羊;产羔数;窝重;ADCY1基因;CYM基因

中图分类号 S827  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2021）24-0141-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.033

Polymorphism of Goat ADCY1 and CYM and Its Association with Litter Size

LI Kun-yu1， 2， HONG Qiong-hua3， TAO Lin2 et al

（1. College of Life Science and Food Engineering， Hebei University of Engineering， Handan， Hebei 056001;2. Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193;3.Yunnan Animal Science and Veterinary Institute， Kunming， Yunnan 650224）

Abstract [Objective]This study aimed to analyze the association between single nucleotide polymorphisms （SNPs） in the adenylate cyclase 1 （ADCY1） and chymotrypsin （CYM） genes and kidding performance in goats.[Method]MassARRAYSNP typing technology was applied to genotype the SNPs of ADCY1 and CYM genes and detect their genetic characteristics in Yunshang black goat （n=544）， Jining grey goat （n=133） and Liaoning cashmere goat （n=91）. Then the association was analyzed between ADCY1 and CYM and kidding performance （litter size， litter weight at birth， litter weight at weaning） in different goats. [Result]The results of population genetics showed that the 4 mutations of ADCY1 gene were low polymorphisms in Yunshang black goat， Jining grey goat， and Liaoning cashmere goat （PIC≤0.25）;CYM gene g.87624254G>A and g.87627082G>A both candidate locus were moderately polymorphic in the three goats （0.25<PIC<0.5）. Chi-square test showed that， except ADCY1 g.43996583C>T in Liaoning cashmere goats， which is in Hardy-Weinberg imbalance （P<0.05）， the other locus are in Hardy-Weinberg equilibrium （P>0.05）;CYM gene g.87624269 two locus G>A and g.87627082G>A were in Hardy-Weinberg equilibrium in the three populations （P>0.05）. The results of association analysis showed that in Yunshang black goats， the ADCY1 gene g.43974472G>A， g.43979904G>A， and CYM gene g.87624254G>A polymorphisms were significantly associated with litter size （P<0.05）;ADCY1 gene g.43996550G>A， g.43996583C>T， CYM gene g.87624254G>A， g.87627082G>A polymorphisms were significantly associated with the primary litter weight （P<0.05）. [Conclusion]In summary， ADCY1 gene g.43974472G>A and g.43979904G>Acan be used as a potential molecular marker for litter size in Yunshang black goats.ADCY1 geneg.43996550G>A and g.43996583C>T locus， CYM gene g.87627082G>A locus can be used as potential molecular markers for litter weight at birth in Yunshang black goats; CYM gene g.87624254G>A locus can be used as potential molecular markers for litter weight selection in Yunshang black goats.

Key words Goat;Litter size;Litter weight;ADCY1 gene;CYM gene

基金项目 国家肉羊产业技术体系专项（CARS-38）;河北省自然科学基金青年项目（C2019402261）;云南省科技创新人才计划（2018HC017）;云南省万人计划——产业技术领军人才项目;中国农业科学院科技创新工程（CAAS-ZDRW202106和ASTIP-IAS13）。

作者简介 李昆谕（1996—），男，甘肃定西人，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种;洪琼花（1968—），女，云南鹤庆人，研究员，从事羊遗传育种研究。李昆谕和洪琼花为共同第一作者。通信作者：储明星，研究员，从事羊优异繁殖性状分子机理研究;刘玉芳，博士，从事动物遗传育种研究。

收稿日期 2021-04-12

山羊（Capra hircus）又称夏羊，是最古老的驯养动物之一[1]。驯化的山羊可为人类提供肉、奶、皮、毛等主要生活资料，在人类农业文明和经济发展中起着重要作用。产羔数是一个复杂的性状，受到多种因素的影响，且产羔数是一个遗传力较低（0.1左右）的性状，是一个受多个基因控制的复杂的阈性状[2-3]。利用传统的育种手段在短时间内难以快速对其进行改良[4-5]。因此，利用分子标记辅助选择技术，可为快速、高效地改良山羊产羔性状提供有效位点，显著提高产羔性状选择效率，加快育种进程，为进一步解析山羊高繁殖力形成的分子机理提供理论基础。

腺苷酸环化酶1（adenylate cyclase 1，ADCY1）是ADCY蛋白的家族成员，定位于山羊4号染色体上，拥有20个外显子。在有机体内，ADCY1负责将ATP催化成环AMP（cAMP），cAMP作为辅助因子参与细胞活动的多种进程[6-7]。Buell等[8-9]研究表明，cAMP可影响卵母细胞减数分裂的过程，其浓度可以影响卵母细胞成熟，进而影响胚胎的质量。Islam等[10]研究表明，在6个中国山羊品种中ADCY1被特异性选择，并与山羊的繁殖力显著相关。胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin，CYM）具有9个外显子，定位于山羊3号染色体上，其功能与胰蛋白酶相似，都属参与蛋白质氨基酸代谢酶，也是一种水解酶。在检测与胰腺分泌功能不全相关联的胰腺疾病的筛选试验方面有一定的应用，然而其对动物生殖的作用尚鲜见报道[11]。Lai等[12]通过对2个品种奶山羊全基因组深度测序筛选到了与产羔性状显著相关的重要候选基因CYM 。该研究利用前期对云上黑山羊（云上黑山羊是以云岭山羊为母本、努比山羊為父本培育而成的我国第一个肉用黑山羊品种[13-14]）的重测序结果，并结合文献阅读，推测ADCY1和CYM基因可能对山羊产羔数有一定的影响，在前期数据结果中筛选出与产羔数相关的8个SNPs位点，其中，在ADCY1基因的SNPs分别为g.43974472G>A、g.43979904G>A、g.43996550G>A和g.43996583C>T，CYM基因的SNPs分别为g.87621057G>A、g.87624254G>A、g.87624269G>A和g.87627082G>A，采用 MassARRAYSNP分型技术，在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊群体中对候选基因的基因型进行检测，分析其多态性与产羔数性状之间的关联性，以期为山羊的高繁殖力分子标记辅助选择育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试样品

共采集768只山羊（2～5岁）的血液，其中云上黑山羊544只，济宁青山羊133只，辽宁绒山羊91只（表1）。将济宁青山羊视为高繁殖力群体，辽宁绒山羊视为低繁殖力群体[13-14]。所有试验用山羊饲养条件环境一致，云上黑山羊拥有至少1胎产羔数记录，部分拥有初生窝重和断奶窝重（3月龄）记录，所有羊均采用颈静脉采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，-20 ℃保存。

1.2 血液DNA的提取

试验样本使用酚氯仿法提取基因组DNA，采用Nano Drop2000检测DNA样本浓度，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.3 基因分型

采用Sequenom MassARRAYSNP分型技术对ADCY1基因和CYM基因突变位点进行检测，相关引物信息见表2。分型样品为DNA，每个样品需要量为20 μL，DNA浓度为40～80 ng/μL。

1.4 统计分析

应用Microsoft Excel 2020软件统计山羊ADCY1和CYM基因突变位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），并进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用 IBM SPSS Statistics 25软件中的一般线性模型，多重比较采用LSD法，对山羊基因型与产羔表型数据进行关联分析，所有数据以平均值±标准误表示（**P<0.01，*P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 ADCY1基因多态性分析

利用Sequenom MassARRAYSNP对768只山羊血液DNA进行基因分型。结果显示，ADCY1基因4个SNPs位点在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊中存在多态性，其中g.43974472G>A、g.43979904G>A和g.43996550G>A位点基因型为GG、GA、AA，g.43996583C>T位点基因型为CC、CT、TT（图1）。

统计济宁青山羊（高繁）和辽宁绒山羊（低繁）品种ADCY1基因4个SNPs位点的基因型频率和等位基因频率（表3），ADCY1基因g.43979904 G>A和43996550 G>A位点的基因型频率和等位基因频率在高繁和低繁山羊群体间差异达到显著水平（P<0.05），且高繁群体和低繁群体的优势基因型均为GG，优势等位基因为G;g.43996583 C>T位点的基因型频率在高繁和低繁山羊群体间差异均达到极显著水平（P<0.01）。

群体遗传学统计表明，ADCY1基因4个突变在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊中均为低度多态（PIC≤0.25）。卡方适应性检验结果表明，除ADCY1g.43996583C>T在辽宁绒山羊中处于Hardy-Weinberg不平衡状态（P<0.05）外，ADCY1其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）（表4）。

2.2 CYM基因多态性分析

基因分型结果表明（图2），CYM基因4个候选位点在3个群体中均存在多态性。其中，CYM基因g.87624254G>A和g.87627082G>A 2个位点在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊中存在GG、GA 和AA 3种基因型（表4）。

由表3可知，CYM基因g.87621057G>A和g.87624269G>A位点的基因型频率和等位基因频率在高繁和低繁山羊群体间差异均达到显著水平（P<0.05），但g.87627082G>A位点的基因型频率和等位基因频率在高繁和低繁山羊群体间差异均不显著。其中g.87624254G>A 和g.87627082G>A位点在高繁和低繁山羊群体中的优势基因型为GA，g.87621057G>A和g.87624269G>A位点在高繁和低繁山羊群体中的优势基因型为GG，优势等位基因均为G。

由表4可知，CYM基因g.87624254G>A和g.87627082G>A 2个候选位点在3种山羊中均为中度多态（0.25<PIC<0.50），CYM基因g.87624269G>A在3种山羊中均为低度多态（PIC≤0.25）。卡方检验表明，CYM基因g.87624269 G>A和g.87627082G>A 2个位点在3个群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。

2.3 候选SNPs位点与云上黑山羊繁殖性能的关联分析

ADCY1基因g.43974472G>A位点AA型的产羔数显著高于GG型（P<0.05），ADCY1基因g.43979904G>A位点GG和GA型的产羔数显著高于AA型（P<0.05）（表5）。CYM基因g.87624254G>A位点GG型的产羔数显著高于GA型（P<0.05）。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T，CYM基因g.87627082G>A 位点多态性与云上黑山羊初生窝重存在显著关联（P<0.05）。CYM基因g.87624254G>A位点多态性与云上黑山羊初生窝重和断奶窝重存在显著关联（P<0.05）。

3 讨论

3.1 ADCY1基因与生殖性状的关系

cAMP作为第二信使的一种，是细胞内信号转导的启动组成部件之一，与细胞活动及生殖密切相关[8，15-17]。Chang等[18-19]研究发现，抑制cAMP表达可使芳香化酶的表达降低，从而影响颗粒细胞的生长发育，ADCY1作为cAMP形成所必需的物质，对于细胞活动尤为重要[20]。因此，ADCY1基因与动物的生殖过程息息相关，或可作为研究动物生殖过程的一个标记。

3.2 ADCY1和CYM基因多态性及其与云上黑山羊产羔数、窝重之间的关系

目前，关于ADCY1和CYM基因与山羊产羔数之间关系的报道较少。该试验发现，ADCY1基因g.43974472G>A位点AA型个体产羔数高于GG型个体0.32只，GA型个体产羔数高于GG型0.07只，笔者推测该位点G>A的突变或是一个优良的突变。ADCY1基因g.43979904G>A位点G>A的突变导致其产羔数下降，推测该位点G>A的突变或是一个不利的突变。ADCY1基因g.43996550G>A和g.43996583C>T位点的突变性都与云上黑山羊的初生窝重显著相关，或可作为筛选云上黑山羊初生窝重的潜在分子标记。

CYM基因g.87624254G>A位点GG型个体相比GA型产羔数高出0.17只，而GA型个体初生窝重显著高于GG型，因此该突变位点还可能需要进行进一步的验证。CYM基因g.87627082G>A位点初生窝重杂合型个体显著高于纯合型个体，或可作为筛选云上黑山羊初生窝重的潜在分子标记。综上所述，ADCY1基因g.43974472G>A和g.43979904G>A位點或可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T位点，CYM基因g.87627082G>A位点或可作为云上黑山羊初生窝重的潜在分子标记，g.87624254G>A位点可作为云上黑山羊窝重选择的潜在分子标记。

4 结论

ADCY1基因g.43974472G>A和g.43979904G>A位点与云上黑山羊产羔数存在显著关联，可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记。ADCY1基因g.43996550G>A、g.43996583C>T位点，CYM基因g.87627082G>A位点与云上黑山羊初生窝重存在显著关联，可作为云上黑山羊初生窝重选择的潜在分子标记。CYM基因g.87624254G>A位点与云上黑山羊初生窝重和断奶窝重存在显著关联，可作为云上黑山羊窝重选择的潜在分子标记。

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