基于代谢组学的锰毒性作用机制分析

陈 健 朱 驯

(盐城工业职业技术学院，江苏 盐城 224005)

随着现代工业化的迅速发展，过多排放废弃物以及重金属，环境变得越来越糟糕。金属(重金属)因其有毒性和对环境具有强烈的生物富集作用而成为最严重的环境污染物类型之一。金属离子可以通过不同的途径缓慢积累在植物和动物体内，以不同的方式移动和循环，从而影响动物的食品安全。且其一旦进入人体，就会伤害人体的健康。人体的健康和公共卫生与食品安全有着密切的联系。食品安全也一直是政府工作的重心。

以各种化学状态或化学形态存在的重金属在进入环境或生态系统后会存留、积累和迁移，造成危害。锰是哺乳动物和许多小型生物的必需营养元素，但它进入环境后会使环境的正常组成和性质发生变化，直接或间接有害于人类生存或造成自然生态环境衰退。长期接触锰会直接损害人体内的神经中枢或导致免疫系统等产生有害因素，并通过周围循环进入大脑，最终会导致神经出现功能障碍。

锰产生毒性作用有很多原因，其容易感染的人群广泛。因此锰的毒性作用和慢性低水平锰的暴露问题成为公共卫生普遍关注的问题。在此次的探讨中，我们在合理建立锰中毒模型后，将高通量蛋白质组学和代谢组学分析用于全面分析锰中毒期间人体蛋白质和小于500的分子的代谢变化。同时也对于代谢通路的改变情况实施了探讨，以期能够对锰中毒进行早期判断和诊治，还为动态性检测的实施等工作提供更为可靠的理论依据。

1 基于代谢组学的锰毒性作用机制分析

1.1 材料与方法

1.1.1 实验仪器和试剂

高温高速离心机，超高效液相色谱仪5600+质谱仪，真空冷冻干燥机，甲酸色谱柱，乙腈，氟化铵，甲醇。

1.1.2 实验方法

实验选取两月大、体积为220 g的30只雄性老鼠，并均无特定病原体。把这些老鼠随机划分成两个组：试验组和对照组。其中，在试验组使用2个重复性的方式，一个重复中用掉10只老鼠。整个测试周期为5周，建立大鼠锰中毒模型。试验结束时，使用抗凝剂从股动脉中收集血液，在4 ℃下以2 000 G离心10分钟，并将血浆迅速储存在液氮中，最后一起转入-80 ℃的冰箱保存，并用于代谢组学的分析。从不同的样本中各取30 μL并将其混合成质控样本。质控样本用来均衡液相色谱质谱联用系统及放置样品前检查仪器状态，以及评估系统稳定性。

1.1.3 样本预处理

从每个样本中各取100 μL，再添加提前预冷的甲醇或者乙腈，并且来回摇晃均匀，在-20 ℃条件下放置10 min；然后采用4 ℃ 2 000 G的条件下进行10 min 的离心处理，再抽取380 μL的上清液，通过原位真空冻干获得冻干粉末，并储存用于随后的分析。如上所述准备质量控制样品，用来评估系统在整个试验过程中的稳定性。抽取乙腈水溶液100 μL加入制备的冻干粉样本中，来回摇晃，进行复溶，离心后(4 ℃，14 000 G，15 min)，收集上清液用于测量离子质荷比的分析。

1.1.4 色谱-质谱(LC-MS)分析

随着年龄增长，自然老化或光老化都会造成皮肤生物黄色素的堆积，其中年龄与脂褐素含量的关系早有报道[20]。随着年龄增长，脂褐素会在人体细胞内逐渐沉积，不仅影响皮肤颜色，而且能够通过挤占细胞空间位置，影响细胞正常功能。随着年龄增长，对脂褐素的清除能力降低，进一步造成脂褐素沉积。

1.1.4.1 色谱条件

色谱条件是：进样量2 μL、流速300 μL/min、柱温25 ℃，借助于反相UHPLC对样本实施进一步的分离处理。正离子模式的流动相组成(HSS T3色谱柱)为A液：0.1%formic acid+99.9%water，B液：0.1% formic acid+99.9% ACN；负离子模式流动相组成A液：0.5mM ammonium fluoride+water，B液：CAN。

为了防止仪器出现问题，顺机持续分析放在4 ℃的自动进样器中的样本，为了提高数据测试中的可靠性，在分析样品的过程中，每5个样品中放一次质量控制样品，它的主要的作用是用来评价和检验系统的稳定

1.1.4.2 质谱条件

使用分离仪器处理样品后，在质谱仪上使用电喷雾，正电和负离子模式条件进行质谱分析。在通过全扫描获取主要质谱图的同时，使用依赖于数据的采集模式和高灵敏度模式获取次要质谱图。

为了防止仪器出现问题，顺机持续分析放在4 ℃的自动进样器中的样本，为了提高数据测试中的可靠性，在分析样品的过程中在每5个样品中放一次质量控制样品，它的主要的作用是用来评价和检验系统的稳定性。

1.1.5 数据处理

使用XCMS程序可以有效地提取原始数据的相应峰面积，并将其转换格式，同时保留时间校正和峰对齐；此外，如何以准确的质量匹配二次光谱取决于代谢物。排除并归一化该组中丢失的离子峰，然后使用多统计分析(例如，监督主成分分析)，并使用各种一维统计分析方法。例如，借助软件编程语言，可以进行火山图分析和变分多元分析。最后，查到与锰的有毒性有关的对机体稳态平衡产生干扰的代谢产物。

1.1.6 代谢物鉴定和通路分析

根据检测所有带电离子的质荷比和强度，以及分析所形成的子离子的质荷比和强度。使用METLIN数据库来识别不容易发现的细胞生长增殖有关的标志物。通过搜索METLIN，KEGG，HMDB，LIPIDMAPS，MassBank和Chemspider来搜索难以找到的生物体征。使用更准确的分子量或MS片段模式数据和文献来搜索确定影响的代谢途径，从而进行准确的生物学解释。

2 结果与分析

2.1 各组血浆样本的典型代谢谱图

代谢组学数据在对分析方式的稳定中起着非常重要的作用。在该实验中，使用了混合均匀的质控样品。质控样品作为真实样品处理，质控样品在正的负的离子批处理过程中每5个样品插入一次，用来评价和检验系统的稳定。质控样品应包括相似的色谱峰形状，分离度，保留时间和响应强度分布。比较了检测过程中质控样品的UHPLC-Q-TOF MS总离子流色谱图。图1显示色谱峰的保留时间和响应强度是一致的，并且峰基本重叠在一起的。它很稳定，几乎没有因设备引起的错误。

图1 QC样品正(a)、负(b)离子模式TIC重叠图谱

使用XCMS软件提取代谢物离子峰，一共有17 917 个离子峰，其中阳离子的模式提取到了12 793个离子，阴离子的模式提取了5 120个。这主要用于进一步处理从每个样品中提取的峰，分析后可以得出结论，样品a属于紧密簇(见图2)。这反映出仪器分析系统的高度稳定性以及有效解释样品之间生物学差异的能力。

本研究应用非靶向代谢组学研究慢性锰暴露对血浆代谢的影响。与常规高效液相色谱质谱联用相比，它拥有更高的灵敏度、峰值和分离度，因此适合代谢组学研究。分析给出了每个样品的典型图，相关情况如图3所示。根据实验条件，对照样品和实验样品的光谱基本相似，峰形良好，峰彼此分离。这表明在这项研究中使用的色谱和质谱条件适合确定样品。

图2 正离子(a)、负离子(b)模式下样本的PCA得分图

图3 对照组和锰处理组中血浆样品的正离子(a)、负离子(b)模式 TIC 谱

2.2 归一化处理

归一化过程可确保代谢组学数据的精确和完整，并降低系统上或技术上的错误概率。同样，代谢物的浓度通常在数量级上，这可能导致对代谢物的错误识别，并发生很大的变化，我们除去代谢产物超过了50%的缺失值；对数转换后通过Pareto标准化代谢物表达水平，应用缩放方法筛选具有生物学和统计学意义的重要代谢物。归一化后，每组样品的正离子和负离子模式数据均显示正态分布(图4)。

(a)

2.2.1 主成分剖析(PCA)

为了确定两组血浆的代谢产物谱中是否存在任何特定差异，采用无监督方法在两种离子模式下评估了实验组和对照组的分辨率。处理所有代谢物后，我们观察了所有样品总体上的分布趋势，从组内外之间的区别，并线性组合以查找可能的离散点。在PC1和PC2尺寸上，正离子模式的变异性的指数为31.9%(图5a)，负离子模式的变异性的总体指数为26%(图5b)。在2D评分图中，两组之间的分离趋势略微但微不足道。这表明对照组与血浆谱有着很大的变化，无明显变化。

(a)

2.2.2 偏最小二乘判别分析

为了用于区分对照组和锰处理组的离子峰，本研究构建了用于监督的偏最小二乘判别分析模型。与模型实现相比，模型更加关注实际的分类差异。这是一种用于监控判别分析的统计技术。主成分分析的思想主要是将高维数据降为低维数据，俗称“降维”。以最大化不同组之间的分离，然后进行监督分析，以最大化代谢物的分离和鉴别，可以预测样品的相应类别。通常，可变的投影重要性被用作帮助筛选标记代谢物的标准。从得分表可以得出结论，锰处理组和对照组在正离子和负离子两种成分模式下存在明显差异。这可以反映出该模型是非常可靠和可预测的。两个得分图显示，正离子和负离子模式倾向于将对照组和锰处理组分开，并且锰暴露改变了有些代谢产物的水准(图6)。

(a)

2.2.3 单变量统计分析

单变量分析经常使用的方式是T检验和分析图；该方法通常筛选FC>2.0和P<0.05的潜在标记代谢物。图7显示了对照组和锰处理组的正离子和负离子形式的相关数据的火山图。灰点代表通过单变量统计分析选择的差异性代谢产物。

(a)

3 结论

由UHPLC-Q-TOF/MS为基础的非靶向代谢组学技术为探究锰诱导的代谢变化给出了不一样的视角。确定了三十几种与锰暴露相关联的血浆代谢产物，其中十几个表现出明显上调的变化，而其他的二十几种表现出明显的下调。这些代谢产物通常涉及嘌呤，不同RCHNH2COOH和脂肪酸的代谢。锰如果暴露就会损害RCHNH2COOH、脂肪酸的代谢。

综合上面所描述的，锰的神经毒性机理为：锰是一种微量金属，在维持正常的细胞功能和新陈代谢中起着重要的作用。但是，锰的过度积累会引起脑功能的退化，由此引起的神经系统疾病称为锰中毒。锰的毒性对氧化应激，线粒体损伤，多巴胺能神经元损伤和内质网应激等方面都是有害的；锰进入人体后会激活周围的免疫系统，导致周围组织产生促炎因子信号。具有炎性的细胞因子通过转运和其他方法穿过血脑屏障，然后再进入神经系统，并引起神经出现炎症；锰暴露可直接在循环系统中产生ROS，破坏血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，产生更多的Aβ；锰进入脑中会引起大脑功能紊乱。除此之外，锰还可以在肝脏中富集，这可能会导致肝脏受损。