非小细胞肺癌免疫治疗获益人群筛选的研究进展

凌徐心仪，张 瑶，钟 华

上海交通大学附属胸科医院呼吸内科，上海 200030

肺癌是当今全球最常见的癌症，肺癌患者占癌症患者总人数的11.6%，占癌症致死总人数的18.4%［1］。在我国，肺癌的发病率和死亡率在所有癌症中居于首位［2］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的绝大多数，预后较差；超过半数患者就诊时已处于晚期，错过了手术时机，而传统的放化疗效果并不理想。肺癌的靶向治疗可用于部分具有特征性基因突变的患者。近年来，免疫治疗逐步走入大众视野，免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）的作用机制是通过阻断免疫反应的抑制途径，恢复并维持免疫系统对癌细胞的攻击。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）和欧洲药品管理局（European Medicine Agency，EMA）已批准在NSCLC中使用抗程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白配体-1（programmed death-1/programmed death-ligand 1，PD-1/PD-L1）单药治疗。帕博利珠单抗（pembrolizumab）可用于一线或二线治疗，纳武单抗（nivolumab）和阿替利珠单抗（atezolizumab）可用于二线治疗。ICIs能给部分NSCLC患者带来长期的生存获益，但是受益人群仅占少数。大部分患者可能承担了昂贵的治疗费用却未产生明显应答，并且可能要承受免疫治疗的多种不良反应，甚至有一小部分患者会面临肿瘤超进展的风险。因此，在应用ICIs之前精准筛选获益人群很有必要。由于NSCLC相关免疫反应的复杂性，有很多环节都可能会影响NSCLC患者对ICIs的应答，如肿瘤细胞表面分子与相关配体、肿瘤微环境中的细胞与分子水平、驱动基因突变等。因此，明确这些环节与ICIs最终疗效的关系，寻找合适的生物标志物来筛选对ICIs高应答的患者，方能给患者最大的益处。本文基于最新的研究报道，围绕NSCLC患者对免疫治疗应答水平的预测指标研究进展做一综述。

1 免疫治疗在NSCLC中的应用现状

近年来，ICIs成为晚期NSCLC的治疗新选择。2017年，ICIs获FDA批准成为特定类型NSCLC的一线治疗方案。2017年美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南中NSCLC专家组建议，PD-L1表达水平≥50%，且表皮生长因子受体基因（epidermal growth factor receptor，EGFR）、间变性淋巴瘤激酶基因（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、C-Ros癌基因1（C-Ros oncogene 1，ROS1）和B-Raf原癌基因（B-Raf proto-oncogene，BRAF）阴性或未知的晚期NSCLC患者可应用帕博利珠单抗作为一线治疗［3-4］。

目前，帕博利珠单抗、纳武单抗、阿替利珠单抗单药可用于后线治疗，帕博利珠单抗（或阿替利珠单抗）联合化疗可用于一线治疗，度伐利尤单抗（durvalumab）可作为放化疗后巩固治疗。这些均已成为针对部分类型NSCLC患者的推荐治疗方案［4］。目前临床上主要依据患者肿瘤的病理类型、临床分期，以及某些重要的生物标志物，如PD-L1表达水平以及驱动基因突变结果，来筛选出可能受益人群，并制定合理的免疫治疗方案。

2 预测NSCLC疗效的生物标志物

2.1 PD-L1

在ICIs药物研发的早期阶段，就有研究人员尝试把NSCLC患者肿瘤细胞的PD-L1表达水平作为预测疗效的生物标志物。一篇系统综述［5］集合了19项评估患者肿瘤PD-L1表达对ICIs治疗晚期NSCLC效果影响的研究，发现大多数证据表明，相较于PD-L1低表达的患者，高表达的患者接受抗PD-1/PD-L1药物［纳武单抗、帕博利珠单抗、度伐利尤单抗、阿替利珠单抗和阿维鲁单抗（avelumab）］单药治疗时获益更大。PD-L1表达水平在预测ICIs疗效方面的应用相对成熟，目前已成为临床医师制定NSCLC患者免疫治疗方案的重要依据。

然而，也有研究表明肿瘤细胞PD-L1表达水平与NSCLC患者对ICIs的应答并不存在相关性。OAK临床试验观察到，对于接受铂类药物治疗后疾病进展的晚期NSCLC患者，无论PD-L1表达水平如何，阿替利珠单抗带来的总生存时间（overall survival，OS）获益均高于多西他赛［6］。PACIFIC临床试验发现，对于不可切除的Ⅲ期NSCLC且放化疗后无进展的患者，无论其PD-L1表达水平如何，接受度伐利尤单抗巩固治疗均有无进展生存时间（progression-free survival，PFS）获益，PD-L1表达水平≥1%的所有患者均有OS获益［7］。CheckMate017试验表明，无论晚期鳞癌患者的PD-L1的表达水平如何，接受后线纳武单抗后OS、PFS、缓解率（response rate，RR）均明显高于多西他赛［8］。而CheckMate057试验却发现对于非鳞NSCLC，疗效的改善均与PD-L1表达水平相关［9］。此类研究证实了PD-L1表达水平用于预测ICIs疗效的局限性，即可能受肿瘤组织学类型等方面的影响；通过与其他已有的，或潜在的生物标志物联合应用可能改善其局限性。

2.2 肿瘤微环境

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）是指肿瘤细胞周围存在的微环境，包括血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子，以及细胞外基质。TME所具有的免疫抑制特性可以阻碍ICIs发挥疗效。研究表明TME中各种免疫细胞、表面分子以及某些化学分子水平均呈现出预测ICIs疗效的潜力。

2.2.1 TME中PD-L1的表达 PD-L1不仅在肿瘤细胞表面表达，在肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）表面也有一定的表达。因肿瘤细胞PD-L1水平还不足以准确预测ICIs疗效，研究人员推断TIL中PD-L1的表达可作为辅助指标，但现有研究仍存在争议。Mazzaschi等［10］的研究发现白细胞分化抗原8（cluster of differentiation 8，CD8）CD8+TIL的PD-1表达与晚期NSCLC患者对纳武单抗治疗的应答水平正相关；Thommen等［11］却发现CD8+TIL的PD-1表达与Ⅳ期NSCLC患者OS和持久的药物反应呈负相关。因此TME中PD-L1的表达是否能够预测NSCLC患者对ICIs的应答水平有待进一步研究明确。

2.2.2 TME中的免疫细胞亚群 研究人员在分析TME对晚期NSCLC患者同步放化疗效果的影响时，依据肿瘤内PD-1/PD-L1表达水平和CD8+TIL水平定义了4种肿瘤免疫微环境类型（tumor immune microenvironment type，TIMT），而特定的TIMT分型可能对于晚期NSCLC的治疗具有一定的指导作用［12-13］。Lin等［14］发现在晚期NSCLC患者中，不同TIMT分型与免疫治疗的OS高度相关。此外，Mazzaschi等［15］将晚期NSCLC患者血液循环中自然杀伤（natural killer，NK）细胞的水平与血液/组织CD8+淋巴细胞中PD-1表达水平相结合，发现这种联合模式可以预测抗PD-1治疗的效果。Cho等［16］发现，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中晚期NK细胞群的百分比在良好应答组中显著高于无应答组。这些结果表明了NK细胞的总体活性或数量可能是预测免疫治疗反应的有效生物标志物。调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）同样可能与免疫治疗反应相关，其主要机制是Treg细胞优先结合共刺激分子，从而诱导其在抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）表面的下调，抑制效应T细胞的激活［17］。研究［18-19］报道，Treg上调了包括NSCLC在内多种肿瘤的免疫检查点分子的表达，提示ICIs的疗效可能受到患者TME中Treg水平的影响。TME中PD-L1+CD4+CD25+Treg的密度也可能是一个有意义的指标，呈现出预测NSCLC患者对PD-1/PD-L1抑制剂应答水平的能力［20］。另外，骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）被证实在转移性黑色素瘤和前列腺癌中与患者对ICIs的应答程度显著相关［21］，有待今后的研究去探索其在NSCLC领域的应用价值。

2.2.3 吲哚胺2，3-二加氧酶 吲哚胺2，3-二加氧酶（indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）参与色氨酸（tryptophan，trp）代谢，是犬尿氨酸（kynurenine，kyn）生成步骤中的限速酶之一。IDO是免疫系统的重要组成部分，具有免疫抑制功能。它在肿瘤发展过程中被激活，有助于恶性细胞逃脱免疫系统的杀伤，可以在NSCLC等多种癌症中过表达［22-24］。Botticelli等［25］将kyn/trp比值及喹啉酸浓度作为IDO活性的指标，发现接受二线纳武单抗治疗前IDO活性较高的NSCLC患者更易发生早期进展，表明IDO活性与NSCLC患者对ICIs的反应相关。

2.3 肿瘤细胞中的基因改变

2.3.1 肿瘤突变负荷 肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）是指在一个特定的肿瘤组织中相对的基因突变数量；如果肿瘤中存在更多的非同义突变，则有更多的新抗原出现，PD-1—PD-L1轴参与阻断的免疫反应就会相应增多，进而影响肿瘤细胞对ICIs的应答。多年前就有研究人员发现在NSCLC中，较高的TMB与使用帕博利珠单抗治疗的PFS相关［26］。此后，Checkmate-227临床试验结果表明，无论高TMB（≥10个突变/Mb）的NSCLC患者PDL1表达状态如何，纳武单抗和伊匹木单抗（ipilimumab）联用作为一线治疗都显著延长了患者的PFS［27］。基于这一研究结果，NCCN-NSCLC专家组于2019第1版NCCN指南中将TMB列为生物标志物，认为有助于筛选适合纳武单抗±伊匹木单抗一线治疗的转移性NSCLC患者，但同时声明了目前尚无标准的TMB测量方法［4］。Wu等［28］对总计纳入4 431名患者的29项研究进行了meta分析，证明TMB对于黑色素瘤及NSCLC的ICIs疗效具有预测作用，结合TMB和PD-L1表达建立分型模型同样是一种有效的预测方式。研究结果提出以下局限性：多数研究在西方人群中进行，今后需要更多纳入亚洲人群的平行研究；基于不同二代测序检测范围的TMB检测结果存在明显的异质性，可能会影响预测的准确性和稳定性，这些影响因素需要在未来的研究中实现标准化。综上，TMB作为疗效预测生物标志物的价值已比较明确，但其应用方式尚无定论，仍需完善合理的检测方式、统一分型标准。

TMB作为生物标志物的潜力不仅局限于基因层面，还可拓展到蛋白水平。TMB可能导致肿瘤新抗原的产生（过渡）。野生型抗原在体细胞突变情况下产生新抗原，而T细胞识别新抗原对于PD-1抑制剂的效应很重要。McGranahan等［29］的研究表明肿瘤中新抗原的数量与TMB相关，且新抗原负荷高的NSCLC患者接受帕博利珠单抗治疗获益明显高于新抗原负荷低的患者。因此，肿瘤相关新抗原的水平可能是预测NSCLC患者对ICIs反应的一个研究方向。

2.3.2 驱动基因 目前已知多种驱动基因阳性的NSCLC患者对免疫治疗的应答很低，部分驱动基因突变已是ICIs临床应用的关键排除标准。携带EGFR突变或ALK重排与NSCLC患者对ICIs的低应答显著相关［30-32］。2020年NCCN指南中NSCLC专家组提出，PD-1表达水平≥1%但具有驱动基因突变的NSCLC患者应首先选用靶向治疗，而非ICIs。在使用PD-1或PD-L1抑制剂之前，至少需检测EGFR和ALK状态，若能补充检测“ROS1融合”和“BRAF突变”为阴性则更加理想［4］。指南未明确指出的其他突变基因也可能与ICIs应答水平相关。Kim等［33］进行了meta分析，调查Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）突变状态是否影响晚期NSCLC患者的ICIs生存获益，发现与多西他赛化疗相比，二线ICIs延长了KRAS突变型NSCLC患者的OS，KRAS野生型NSCLC的患者的OS却无显著改善。KRAS突变往往伴随丝氨酸苏氨酸激酶（serine/threonine kinase 11，STK11）突变；最近的一项研究不仅证实了STK11/KRAS的关联，还表明STK11/肝脏激酶B1（liver kinase B1，LKB1）突变与KRAS突变患者对纳武单抗的不良应答有关［34］。一些非常见肿瘤基因的突变同样可能预测NSCLC患者对ICIs的应答水平。在NSCLC患者中，磷脂酰肌醇-4，5-双磷酸3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）、EGFR或STK11突变者对ICIs无反应，而KRAS、肿瘤蛋白P53（tumor protein P53，TP53）突变型或间质表皮转化因子（mesenchymal to epithelial transition factor，MET）基因14号外显子跳跃突变者对ICIs反应良好［35］。未来仍需更多研究挖掘众多肿瘤驱动基因中可用于预测ICIs疗效的潜在生物标志物。

2.3.3 T细胞炎性基因 T细胞炎性基因涵盖了一系列与肿瘤免疫反应相关的基因，这些基因的表达产物与肿瘤发生发展及对ICIs的应答水平息息相关。Higgs等［36］发现在接受ICIs治疗的NSCLC患者中，四基因干扰素γ（interferon-γ，IFNγ）高信号患者相较于低信号患者，客观缓解率（objective response rate，ORR）、中位PFS和OS显著提高，且这一趋势与PD-L1表达水平无关。所采用的四基因包含IFNγ、CD274、淋巴细胞激活基因-3（lymphocytes activate gene，LAG3）、趋化因子配体9（chemokine ligand 9，CXCL9）。Ayers等［37］报告了一种18基因T细胞炎性基因表达谱（gene expression profiles，GEP）在NSCLC等多种实体瘤中均可用于预测帕博利珠单抗的疗效。Danaher等［38］也将18个T细胞炎性基因纳入考虑，包括抗原提呈相关（PSMB10、HLA-DQA1、HLA-DRB1、CMKLR1）、趋化因子表达相关（CCL5、CSCL9、CD27、CXCR6、IDO1、STAT1）、T细胞/NK细胞丰度相关（HLAE、NKG7、CD8A）、T细胞衰竭相关（TIGIT、LAG3、CD274、PDCD1LG2、CD276）的4大类基因，将它们的表达水平标准化后加权线性组合，建立肿瘤炎症特征（tumor inflammation signature，TIS）评分标准。将TIS算法应用于癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库公开的9 000多种肿瘤基因表达谱，发现对PD-1抑制剂敏感的肿瘤具有更高的TIS评分，可见T细胞炎性基因的检测在筛选NSCLC获益人群方面的潜力。

2.3.4 微卫星不稳定性/错配修复受损 微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）是由DNA错配修复受损（mismatch repair deficiency，MMRd）导致的遗传超变异性。MMR可以纠正DNA复制过程中自然发生的错误，例如单碱基错配或短插入和缺失。MMR功能异常的细胞无法纠正DNA复制过程中发生的错误，从而导致了新型微卫星碎片的产生。MSI的存在提示MMR不能正常运作，其高低与修复DNA错误的能力成反比，因此MSI可作为代替MMRd水平的评估指标［39］。基于一系列探究各种肿瘤MMRd和帕博利珠单抗疗效之间关系的Keynote试验，2017年FDA批准：若具有MMRd的恶性实体瘤在接受治疗后仍进展，且没有其他合适的治疗选择，可使用帕博利珠单抗。此外，已有多项研究［40-41］证明，在部分实体瘤尤其是结直肠癌中，MSI与患者对ICIs的响应密切相关。在肺癌领域，目前MSI/MMRd对于ICIs疗效的预测价值仍然未知。

3 ICIs治疗NSCLC效果的复合预测模型

对于PD-L1表达水平与TMB这2种目前比较成熟的生物标志物，若将其中之一作为独立因素进行对NSCLC患者的疗效预测，可靠性往往不足。研究人员因此尝试联合双重或多重生物标志物建立预测模型，结果表明NSCLC患者的TMB与PD-L1表达水平之间并无相关性，但其作为双重变量可以提高对ICIs疗效的预测能力［42］。最具热度的模型是运用PD-1/PD-L1表达水平结合CD8+TIL水平定义4种TIMTs，但基于这一模型的研究得到了不完全一致的结果［10-14］。Lee等［43］提出了一个三变量模型，纳入了患有NSCLC等21种癌症的7 187名患者，分析了36种生物标志物与ICIs疗效的相关性，它们分别与肿瘤新抗原、肿瘤免疫微环境和检查点相关；根据这一规律将这些生物标志物划分为3大类型，对各类型中相关性最强的生物标志物提出双变量和三变量的复合模型猜想，发现TMB与CD8+T细胞丰度（estimated CD8+Tcell abundance，eCD8T）组合的模型预测准确性显著高于任一单变量，再加入高PD-1mRNA表达样品的比例（fraction of high PD-1 messenger RNA expression samples，fPD1）构建三变量模型后，其与患者对ICIs的反应显示出更高的相关性（Spearman，R=0.90）。明显偏离三变量模型预测结果的瘤种仅为多形胶质母细胞瘤和微卫星稳定型结肠癌。NSCLC患者对ICIs的应答与三变量模型高度相关，表明这一模型应用于NSCLC的ICIs疗效预测很有前景。此外，还有学者提出联用多重生物标志物建立评估流程以实现个性化免疫疗法的设想，列出一系列与癌症免疫相关的特征，包括辅助性T细胞1（helper Tcell，Th1）功能、PD-L1表达、肿瘤外围T细胞、主要组织相容性复合体-1（major histocompatibility complex-1，MHC-1）表达以及其他免疫抑制因子和细胞，依据这些指标为患者逐步制订个体化的免疫治疗方案［44］。具有不同免疫特征的患者可能受益于不同的治疗策略，这种筛选流程使得癌症的精准免疫治疗更进一步。

4 结语

免疫治疗可改善NSCLC的预后，但目前尚无理想的方案来筛选获益人群，因此寻找合适的生物标志物显得尤为重要。目前肿瘤细胞的PD-L1表达水平以及TMB是2个已应用于临床的生物标志物，但均存在应用范围局限、测量方式未标准化的问题，可靠性也有待明确。近年的研究已经发现了多种分子或基因具有成为生物标志物的潜力。在蛋白水平，TME中PD-L1、各免疫细胞亚群（CD8+TIL、NK、Treg等）数量和IDO的表达均与NSCLC接受ICIs治疗的良好应答相关。基因层面同样值得探索，肿瘤的部分驱动基因突变水平和MSI水平不同程度地呈现出预测NSCLC患者ICIs应答水平的能力。此外，这些生物标志物在联合应用时的疗效预测能力表现良好。因此，联合应用不同的生物标志物，建立双变量或多变量模型是将来ICIs疗效预测的发展方向。

参·考·文·献

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