红豆杉提取物维康醇对膀胱癌T24细胞增殖抑制的实验研究

刘宏伟 左玲 柳建军 许志坚 桂志明

【摘 要】 目的：探讨红豆杉提取物维康醇抑制膀胱癌T24细胞增殖的机制。方法：用维康醇处理膀胱癌T24细胞，MTS法检测维康醇对细胞增殖的影响;流式细胞术检测维康醇对细胞周期的影响;实时荧光定量PCR和westernblot检测Cyclin D1、CDK4、p21 mRNA和蛋白表达水平的影响。结果：维康醇呈浓度和时间依赖性抑制T24细胞的增殖;维康醇诱导细胞周期阻滞于G1期，并下调Cyclin D1、CDK4表达，上调p21表达。结论：维康醇能够抑制膀胱癌T24细胞的增殖，可能与下调Cyclin D1和CDK4表达，上调p21表达，导致细胞周期于G1期阻滞有关。

【关键词】 红豆杉;维康醇;膀胱癌;增殖;Cyclin D1

【中图分类号】R285.5   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2021）21-0015-04

Inhibitory Effect of Alteronol， an Extract from Taxus Chinensis， on the Proliferation of Bladder Cancer T24 cells

LIU Hongwei1 ZUO Ling2 LIU Jianjun1 XU Zhijian1 GUI Zhiming1

1.Department of Urology， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China;

2.Department of Traditional Chinese Medicine， the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524003，China

Abstract：Objective To investigate the mechanism of the inhibitory effect of Alteronol on the proliferation of bladder cancer T24 cells.Methods Bladder cancer T24 cells were treated with Alteronol. MTS assay was performed to test the effect of Alteronol on cell proliferation. Flow cytometry was used to detect the effect of Alteronol on cell cycle， and real-time quantitative PCR and western blot were performed to detect the expression of cyclin D1， CDK4 and p21.Results Alteronol inhibited the proliferation of T24 cells in a concentration and time-dependent manner. Alteronol induced cell arrest in G1 phase， down-regulated the expression of cyclin D1 and CDK4， and up-regulated the expression of p21.Conclusion Alteronol can inhibit the proliferation of bladder cancer T24 cells， which may be related to the down-regulation of the expression of Cyclin D1 and CDK4 and up-regulation of p21 expression， leading to cell cycle arrest in G1 phase.

Keywords：Taxus Chinensis; Alteronol;Bladder Cancer;Proliferation; Cyclin D1

紅豆杉又名紫杉、赤柏松。辛、甘，大温，归胃、肝经。红豆杉的根、茎、叶都可以入药，具有利尿消肿、通经止痛的作用。《本草纲目》记载红豆杉具有治疗伤寒、霍乱、排毒等功效。红豆杉是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌中药，具有解毒散结之疗效，在1992年被FDA批准用于治疗晚期肺癌、卵巢癌、子宫癌等[1]。药理研究[2]表明红豆杉具有诱导癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移、抑制血管生成、影响癌细胞代谢周期、逆转肿瘤多耐药性等抗癌药理作用，其提取物紫杉醇对晚期乳腺癌、卵巢癌、消化道肿瘤、非小细胞肺癌等有明显疗效，总有效率高达75%以上，对膀胱癌也有较好的疗效[3-5]。维康醇（Alteronol）是从云南红豆杉树皮中分离提取出微生物菌诱变株，对其菌丝体进行特殊发酵、纯化而获取的一种新型单体化合物，其分子式为C20H14O6，分子量为350.3，是维泰醇（Alternol，C20H16O6，分子量为352.3）的同型异构体[6]，与临床上常用抗肿瘤药物紫杉醇的来源相同[7]。

研究[6，8]表明维泰醇类化合物能够抑制多种肿瘤细胞的增殖，但对维康醇的研究不多。维康醇不仅可以抑制白血病HL-60细胞[9]、肝癌细胞[10]的增殖，而且可以诱导肺癌及前列腺癌细胞的凋亡[11-12]。目前维康醇对膀胱癌细胞的作用未明，本研究拟探讨维康醇对膀胱癌细胞增殖、周期的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人膀胱癌T24细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 药物、试剂及仪器 维康醇（汕头市双骏生物科技有限公司）;RPMI-1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司;青霉素/链霉素、MTS、Propidium Iodide、RNase A购自Sigma公司;细胞培养箱购自BINDER公司;SPARK 10 M酶标仪（TECAN公司）;流式细胞仪（美国BD公司）;QuantstudioTM DX system实时荧光定量 PCR仪（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养液将T24细胞制备成细胞悬液，置于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中进行培养，每1～2天换液，取对数生长期细胞用于实验研究。

1.2.2 MTS法检测维康醇对T24细胞增殖的影响将T24细胞铺于24孔板，24 h后分别用不同浓度的维康醇（4、8、12、16 μmol/L）进行处理，对照组用等体积RPMI-1640培养基替代，48 h后收集上述五组细胞，重悬细胞并计数，以1×103个/孔接种于 96 孔板中，每个孔 200 μL，放在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱培养24 h，然后向每个孔加入 20 μL MTS 溶液，置于细胞培养箱中孵育 2 h，选取 492 nm 波长，在酶标仪上测定OD值，重复三次，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（Atreat-Ablank）/（Acontrol-Ablank）×100%。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 收集经维康醇处理24 h后的T24细胞于离心管中，离心去培养液，加入3 mL预冷的70%乙醇，用枪头吹打使细胞分散，置于4 ℃冰箱过夜，然后离心去乙醇，用PBS洗涤2次，加入0.05 mg/mL的Propidium Iodide和0.5 mg/mL的RNase A，避光下染色30min，上流式细胞仪检测细胞周期比例。

1.2.4 实施荧光定量PCR 收集经维康醇不同处理组的T24细胞，RNAiso提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录反应，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。将cDNA稀释10倍，按10uL反应体系采用两步法进行PCR扩增。所用引物如下：CyclinD1-F：GCATGTTCGTGGCCTCTAAG，[JP4]CyclinD1-R：CGTGTTTGCGGATGATCTGT;CDK4-F： [JP]AGTGTGAGAGTCCCCAATGG;

CDK4-R： CCTTGATCTCCCGGTCAGTT;p21-F： TGCCCAAGCTC TACCTTC C，p21-R： CAGGTCCACATGGTCTTCCT;GAPDH-F：GGAGCGAGATCCCT CCAAAAT;GAPDH-R：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。反应条件：95  ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸40 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt统计分析。

1.2.5 Western blot 用12 μmol/L的维康醇孵育T24细胞，48 h后弃培养基，PBS清洗一次，加入RIPA裂解液，收集对照组和处理组蛋白，BCA法测定蛋白浓度，按比例加入loadingbuffer，98 ℃ 5min進行蛋白变性。每孔加入30 μg蛋白进行电泳，浓缩胶设置80 V，分离胶设定100 V，电泳90min。然后采用PVDF膜进行转膜，250 mA，2h。5%脱脂奶粉封闭1 h，分别孵育Cyclin D1、CDK4、p21兔多克隆抗体（1∶1000，proteintech公司）及GAPDH鼠单克隆抗体（1∶10000，ABclonal公司），4 ℃过夜。TBST洗膜，室温下孵育二抗1 h，洗膜后加入化学发光液曝光拍照。

1.2.6 统计学方法 统计分析采用SPSS20.0软件包，计量资料采用均数加减标准差（x±s）表示，均通过正态性检验，组间计量资料比较采用本t检验，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 维康醇呈浓度依赖性抑制膀胱癌细胞增殖 以不同浓度的维康醇（4、8、12、16 μmol/L）处理膀胱癌T24细胞48 h，细胞增殖抑制率逐渐增加，分别为9.33%、16.26%、50.56%和61.03%。不同浓度维康醇组OD值与对照组相比，差异均具有统计学意义。见表1。

2.2 维康醇呈时间依赖性抑制膀胱癌细胞增殖 以12 μmol/L的维康醇作用于膀胱癌T24细胞，分别作用24、48、72、96 h，MTS结果显示随着时间的延长，维康醇对T24细胞的抑制率逐渐增加，维康醇处理96 h后，细胞的抑制率达74.30%，说明维康醇抑制T24细胞增殖存在时间依赖性。见表2。

2.3 维康醇对膀胱癌细胞周期及相关蛋白的影响 流式细胞术测定细胞周期结果显示，当以12 μmol/L的维康醇处理T24细胞24 h后，G1期比例由38.77%升至52.01%，S期比例由47.30%降至38.11%，G2期比例稍有下降（图1A），进一步对周期相关蛋白基因进行qRT-PCR和western blot检测，结果显示，与对照组相比，维康醇作用的T24细胞中CDK4和Cyclin D1的mRNA和蛋白水平显著降低，p21的mRNA和蛋白水平明显上调（图1B、1C）。

3 讨论

维康醇是从云南昆明红豆杉树皮中提取、合成的一种新型单体化合物。研究[13]表明，维康醇可通过引起细胞周期阻滞、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等发挥其抗癌作用。如维康醇可能通过线粒体调控的内源通路诱导肺癌A549细胞的凋亡[11]，通过下调细胞周期蛋白CyclinD1和细胞周期蛋白依赖性激酶的底物磷酸化的Rb蛋白表达抑制白血病HL-60的增殖[9]。维康醇还可以抑制Akt/mTOR和TGFβ/Smad3通路，与自噬抑制剂3-MA联合应用不仅能显著抑制黑色素瘤的生长，而且能抑制肿瘤的侵袭和迁移[14]。维康醇和阿霉素联合应用可显著抑制乳腺癌4T1细胞周期相关蛋白CDC2和Cyclin B1的表达水平[15]，诱导细胞周期阻滞于G2/M期，从而抑制细胞增殖[16]。维康醇诱导前列腺癌细胞死亡的方式主要为时间依赖性的晚期凋亡，其效果优于传统化疗药物伊立替康（CPT-11）、多西他赛及紫杉醇[12]。本研究采用不同浓度的维康醇干预膀胱癌T24细胞，结果表明维康醇显著抑制细胞增殖，存在时间和剂量依赖性，说明维康醇亦对膀胱癌发挥一定的抗癌作用。

G1/S期和G2/M期是细胞周期的两个关键限制点，其中G1/S期在启动细胞周期过程中发挥关键作用。为了探讨维康醇抑制膀胱癌增殖的作用机制，进一步检测了其对细胞周期的影响，结果显示维康醇处理后T24细胞的G1期比例明显增加，S期比例明显下降，与既往研究结果一致。刘亮亮等[9]研究发现以1.6 μg/mL维康醇孵育白血病HL-60细胞24 h后，细胞的G1期比例由34.9%增加至53.0%，S期比例由54.4%减少至32.9%。在G1/S限制点，CyclinD1、CyclinE分别与CDK4、CDK2形成激酶复合物，促进细胞周期G1/S转化，促进细胞异常增殖、恶变。HeLa细胞经维康醇处理后，Cyclin D1和CDK4蛋白水平显著下降[17]。本研究同样表明，维康醇处理膀胱癌细胞24 h后 Cyclin D1和CDK4表达明显下调，p21表达上调，说明维康醇可能通过下调Cyclin D1和CDK4表达，上调p21表达，使T24细胞在G1期受阻，进而抑制膀胱癌细胞的增殖。

诱导细胞凋亡是抗肿瘤药物研发的作用机制之一，目前研究报道大多数肿瘤细胞经维康醇处理后出现了凋亡现象，如30 μmol/L维康醇作用于HepG2细胞48 h后，细胞凋亡率显著升高[10]。唐宇哲等通过维康醇孵育前列腺癌PC3细胞12 h，PC3晚期细胞凋亡率达14.8%±1.2%，明显高于正常前列腺细胞株BPH1的6.8%±1.1% [12]，但经维康醇处理的前列腺癌细胞株DU145和白血病HL-60的凋亡比例较低，均低于10%[9， 12]。维康醇是否也诱导膀胱癌细胞凋亡有待进一步研究。

综上所述，维康醇能够抑制膀胱癌T24细胞的增殖，其可能与下调Cyclin D1和CDK4表达，上调p21表达，导致细胞G1期阻滞有关，但其深入机制有待后续进一步研究。

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（收稿日期：2021-03-12 编辑：刘斌）