雌激素通过氯通道影响骨质疏松的研究进展

方焕坤 邓志钦 段莉 李文翠 王大平*

1.汕头大学医学院，广东 汕头 515041

2.深圳市第二人民医院骨科，广东 深圳 518035

1 成骨细胞-破骨细胞代谢平衡与骨质疏松

1.1 骨质疏松症的定义和流行病调查情况

2001年，美国国立卫生研究院骨质疏松委员会发表了一份骨质疏松症(osteoporosis，OP)共识的定义：骨质疏松症为骨骼生长失调，有损害骨骼强度且诱发骨折风险的疾病，其典型特征是骨皮质变薄、骨小梁之间失去连接[1]。世界卫生组织定义骨质疏松症为一种全身代谢性骨病，其特点是当骨量减少和骨组织的微细结构受损时，骨的脆性增加，易于发生骨折。国际骨质疏松基金会预测绝经后女性中约有1/3罹患骨折，而50岁以上的男性约有1/5罹患骨折[2]。随着人口老龄化的加剧，骨质疏松症已逐渐成为50岁以上群体的一个全球性健康问题，我国老年人比例不断上升，骨质疏松症已经成为社会面临的严重挑战[3]。我国50岁以上人群骨质疏松症患病率为女性20.7%，男性14.4%，且骨质疏松性骨折发病率也逐年攀升，女性高达24.43%，男性达15.58%[4]。骨质疏松症患者结局常常是脆性骨折甚至残疾，这都将给家庭及社会带来巨大的经济负担，且在接下来几十年中形势愈加严峻。据统计，2010年约有233万例骨质疏松性骨折发生，花费9.45亿美元。女性骨折的发生率约为男性骨折的3倍，占总费用的76%，到2035年，骨质疏松症相关骨折的年数量和费用将翻一番，到2050年将增加到599万例骨折，花费254.3亿美元[5]。由此看出，骨质疏松症已经成为我国50岁以上人群的重要健康问题，中老年女性骨质疏松问题尤为严重。

1.2 成骨细胞-破骨细胞代谢平衡与骨质疏松

成骨细胞(osteoblast，OB)和破骨细胞(osteoclast，OC)是骨重塑过程中的两种主要细胞，协调OB与OC的生成与活性，能平衡骨的吸收与形成过程。已有研究表明，成骨细胞和破骨细胞可以通过直接的细胞-细胞接触、细胞因子和细胞外基质相互作用、相互沟通。成骨细胞可通过多种途径影响破骨细胞的形成、分化或凋亡，如OPG/RANKL/RA[6]。一旦上述骨吸收和骨形成之间的动态平衡被破坏，如女性更年期，骨量逐渐减少就会表现出来，骨骼内部结构空隙增加、骨骼机械强度渐进性减弱，最终导致骨折的易发[7]。

2 雌激素对骨质疏松的影响

2.1 雌激素对骨质疏松或绝经后骨质疏松症的影响

雌激素调节成骨细胞和破骨细胞的活动，在调节骨代谢中起重要作用。绝经后，雌激素缺乏，抑制骨形成，使得骨髓扩张和骨内膜吸收导致骨丢失，骨强度降低[8]。研究表明，雌激素对维持骨吸收和骨形成的平衡具有着极其重要的作用，雌激素可以促进破骨细胞凋亡，从而抑制骨吸收，但这种促凋亡作用的分子机制尚不清楚。此外，雌激素抑制成骨细胞产生破骨细胞分化因子，并通过这种间接机制抑制破骨细胞的形成和骨吸收[9]。绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)又称原发性骨质疏松症(Ⅰ型骨质疏松)，是对老年妇女健康危害很大的常见病和多发病。其发病机制与雌激素耗竭有关，随着年龄增长，雌激素耗竭会导致骨质流失加重。这种骨骼疾病模式包括普遍存在的骨小梁丢失和穿孔，使得椎体和桡骨远端这类松质骨骨折风险增高[8]。雌激素可减少更年期引起的骨代谢加速，并可防止全身各骨骼部位的骨丢失。系统口服或经皮雌激素治疗(estrogen therapy，ET)或雌激素加黄体酮治疗(estrogen plus progestin therapy，EPT)对妇女保护的有益影响已被确立。不幸的是，雌激素治疗增加了子宫内膜癌、中风、冠心病(coronary heart disease，CHD)和凝血栓塞事件的风险[10]。Kyunghee等[11]研究发现，RANKL通过诱导ERK1和ERK2磷酸化，促进破骨细胞分化。实验表明，雌激素下降与OPG/RANKL比值升高有关，雌激素在绝经早期通过OPG/RANKL途径抑制破骨细胞，从而改善骨丢失，且随着雌激素剂量的增加，局部骨血管的形成增加，提示雌激素可能通过血管生成影响骨质疏松症[12]。此外，肿瘤坏死因子α(TNF-α)在绝经后骨质疏松症的发病机制中起着重要作用，它可以抑制间充质干细胞(MSC)成骨分化从而导致骨形成受损[13]。雌激素存在时，可促进成骨细胞周期进程加速细胞增殖，有报道指出雌激素可影响大鼠成骨细胞分泌生长因子-β(TGF-β)及类胰岛素生长因子-I(IGF-I)，TGF-β调节早期骨髓基质细胞向成熟成骨细胞分化，IGF-I信号是生长激素诱导骨生长的主要介质，IGF-I和配体-受体(efn Eph)信号转导相互作用，调节骨骼生长和维持[14-15]。另外，酪氨酸激酶-2 (Pyk2)对骨形成具有重要作用，缺乏Pyk2的雌鼠(Pyk2-ko)骨量增加，骨形成率增加，pyk2的缺失使雌激素刺激OB的分化和矿化[16]。

2.2 雌激素受体在绝经后骨质疏松症中的作用

雌激素受体(ER)介导大部分的雌激素反应，ER属甾体激素类超家族成员，是一类与配体结合激活的核转录因子。经典的ER信号转导途径：雌激素通过直接与核内雌激素α或β受体结合，直接激活下游靶基因的活化。雌激素α和β受体(ERα和ERβ)在成骨细胞和破骨细胞均有表达，提示雌激素可通过结合表达在成骨细胞和破骨细胞上的受体从而发挥作用[17]。ERα在成骨细胞祖细胞中可通过调节骨膜骨形成的增加起关键作用。此外，ERα可刺激成骨细胞的信号维持松质骨骨量。但目前，ERα信号在成熟成骨细胞保持松质骨质量的分子机制仍不清楚[9]。

3 氯离子通道在调节成骨细胞中的重要作用和机制

3.1 氯通道的一般生理功能及在调节骨形成中的作用

氯离子具有重要的生物学功能，是机体内环境含量最丰富的阴离子。氯通道细分为5个氯离子通道家族：配体门控阴离子通道、CFTR、ClCs、bestrophins和anoctamins[18]。ClC-3氯离子通道是一种电压门控型离子通道，在哺乳动物细胞中广泛表达，其作用主要有维持细胞体积平衡、调节细胞兴奋性、离子稳态、溶酶体酸化和跨膜转运相关。破骨细胞通过质子泵分泌氢离子，氯离子通过靠近钙化骨的底面细胞膜上的氯离子通道，溶解骨中的矿物质，而且ClC-3可通过成骨细胞促进新骨的生长[19]。氯离子交换器ClC-3和ClC-5在活性成骨细胞的表面高表达[20]。卢晓琳等[21]通过研究不同ClC-3氯离子通道表达水平对成骨相关基因的影响表明，成骨细胞中ClC-3氯离子通道的表达有助于成骨细胞对PTH的刺激，从而介导成骨细胞的分化[21]。ClC-3氯通道蛋白表达水平增加，可以上调下游Runx2基因表达，从而促进成骨分化[22]。此外，Cl--H+逆向转运蛋白ClC-3和ClC-5还能驱动成骨细胞的矿化和调节精细骨结构[23]。有研究表明，C1C-3过表达导致小鼠的皮质骨和松质骨骨量减少，骨结构变差，提示C1C-3可能参与了骨形成或骨吸收[24]。没有ClC-3和ClC-5，成骨细胞无法在体外矿化，Clcn3/Clcn5双基因敲除对动物来说可能是致命的[25]。

3.2 氯离子通道蛋白在骨形成信号调节通路中的作用

Brum等[26]研究发现，在成骨细胞分化过程中人类间充质干细胞(hMSCs)CLIC3基因表达强烈上调，而脂肪细胞中的CLIC3表达下降，与成骨细胞的表达相反。当利用慢病毒转导使间充质干细胞CLIC3过表达后导致基质矿化增加60%，而敲除CLIC3基因后细胞基质矿化降低了78%～88%。

4 氯离子通道在调节破骨细胞中的重要作用和机制

骨骼也是时刻都在进行着物质代谢，成骨细胞和破骨细胞是骨骼不断新陈代谢的基础。正常生理条件下，破骨细胞与成骨细胞相互协调，通过蚀骨和成骨的动态平衡机制，维持着骨骼的正常代谢和机体的正常运作。RANKL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员之一，由成骨细胞和骨细胞表达。RANKL的受体RANK存在于破骨细胞和破骨细胞前体上，当RANKL与RANK结合时，破骨细胞分化被激活[27]。骨细胞还分泌RANKL诱饵受体骨保护素(OPG)，OPG结合RANKL与RANK竞争，从而抑制破骨细胞分化[28]。OPG/RANKL比值受雌激素调节，其比值下降可侧面增强RANKL-RANK的相互作用，RANKL刺激破骨细胞前体退出细胞周期并最终分化，所以雌激素水平下降破骨细胞被大量活化[29]。氯通道的开放是破骨细胞骨吸收的关键步骤。当破骨细胞被活化，活化后的破骨细胞会贴附靠近在骨骼表面，大量聚集质子泵和氯通道，当质子泵与氯通道被激活时，则大量分泌 HCl至吸收腔面，调节骨吸收[30]。

5 雌激素、雌激素受体和氯离子通道在骨代谢中的作用

近年研究发现雌激素通过受体依赖性或非受体依赖性两种方式作用于离子通道。成骨细胞的成骨功能也受雌激素的调节。有研究表明，当成骨细胞中I型电压门控型钙离子通道被激活后，可以减少卵巢切除(ovx)骨质疏松小鼠模型中的骨丢失；在使用钙通道阻滞剂后，成骨细胞标志物的转录显著下降，表明信号通过内源性钙离子通道调节骨形成[31]。钙通道的表达可增强骨小梁的生长，防止雌激素缺乏引起的骨丢失。雌激素与离子通道在细胞功能表达上关系密切，其中氯离子通道是雌激素调控细胞功能的重要途径。ClC-3已被证实参与细胞迁移，雌激素可激活ClC-3基因的表达，促进其翻译，促进细胞生长[32]。ClC家族中的Cl-通道在成骨细胞中表达并且与骨生理学和病理学相关，通过研究雌激素对MC3T3-E1成骨细胞氯通道的作用，发现17β-雌二醇可诱导成骨细胞产生一个氯电流，且该电流可被雌激素受体拮抗剂所抑制，雌激素可通过细胞膜表面的ERα激活氯通道，表明ClC-3氯通道可能是雌激素调控成骨细胞活性的靶点之一[33]。另外，17β雌二醇可提高I型胶原蛋白表达和碱性磷酸酶活性，促进氯通道蛋白表达；当使用氯通道阻滞剂沉默氯离子通道表达后，阻止了成骨细胞分化，提示雌激素可通过激活ClC-3氯离子通道调节骨形成，增强成骨细胞的成骨分化[34]。

6 Wnt信号通路

在生理条件下，成骨和破骨在多种细胞参与和信号途径调解下达到动态平衡。Wnt配体通过β-连环蛋白依赖性和非依赖性信号传导在各种器官的发育和稳态中发挥核心作用。自从发现低密度脂蛋白受体相关蛋白5(Lrp5)基因突变与人类交替之间的因果关系以来，Wnt/β-catenin信号在骨量中的关键作用已经通过大量研究确定。Wnt蛋白在细胞分化前可抑制成骨细胞前体细胞的凋亡，从而促进间充质干细胞向成骨细胞的分化[35]。Wnt/β-连环蛋白信号传导的激活诱导促进成骨细胞分化的转录因子osterix的表达。此外，该信号传导诱导骨保护素的表达，骨保护素是成骨细胞谱系细胞中的破骨细胞抑制因子，以防止骨吸收。Wnt信号对正常骨形成是必不可少的。Wnt受体Lrp5的失活突变导致骨质疏松性假性胶质瘤，而激活突变导致高骨量。Wnt1功能缺失突变可导致成骨不全和早发型骨质疏松症。实验表明Wnt1是破骨细胞进行骨吸收的来源之一，且Wnt1可能有助于成骨细胞分化与骨吸收位点的耦合[36]。最近的研究也表明，Wnt5a可增强破骨细胞的形成。相反，Wnt16通过β-连环蛋白非依赖性信号传导抑制破骨细胞形成[37]。成骨细胞及其前体、骨细胞和破骨细胞能够分泌各种Wnt配体，参与骨重建，Wnt /β-catenin信号通路直接提高成骨细胞分化和骨形成，而间接地抑制破骨细胞分化和骨吸收，Wnt通路的激活还会导致细胞外基质成分如纤维连接蛋白或胶原的分泌增加，这些成分可以改变骨生化和结构特性[38]。Wnt信号通路对骨调节发挥着重要的作用，但其分子机制目前尚不清楚，可能与氯通道开放有关。

综上所述，骨质疏松症是一类常见的代谢性疾病，在人群的发病率逐年上升，尤其是面临绝经期的中老年女性，严重影响社会经济及健康。绝经后骨质疏松是老年女性常见病，目前仍然没有改善绝经后妇女骨质疏松症的安全有效的药物。雌激素调节成骨细胞和破骨细胞的活动，在调节骨代谢中起重要作用，而氯离子通道与骨代谢密切相关，不仅可以通过破骨细胞溶解骨中的矿物质，调节骨吸收，而且通过成骨细胞促进新骨的生长。雌激素可激活成骨细胞的氯电流，促进破骨细胞凋亡，雌激素与氯离子通道的相关机制可能是：雌激素通过细胞表面雌激素受体，激活氯通道，通过Wnt信号途径，抑制破骨细胞形成并促进成骨细胞表达，从而调节骨代谢。但Wnt信号途径如何影响骨调节，其分子机制尚不清楚，有待进一步的科学研究。通过研究及探讨氯通道调控骨形成的机制，有望为离子通道型抗骨质疏松症药物的研发提供理论基础，研发新型抗骨质疏松药物。