13C标记的PLFA法在微生物学中的应用及其在中药生态种植研究领域的展望△

刘长征，姜晓琳，蔡启忠，杨全，周良云

广东药科大学 中药学院/国家中医药管理局 岭南药材生产与开发重点研究室/国家中药材产业技术体系广州综合试验站/广东省南药规范化种植与综合开发工程技术研究中心，广东 广州 510006

碳循环是生态系统中重要的生物地球化学元素循环之一[1]，微生物参与了其中多个重要的循环过程。了解微生物在碳循环过程中的具体作用，有助于揭示微生物对环境变化的响应机制。磷脂脂肪酸(PLFA)作为微生物的标志物已被世界各地的学者广泛应用到微生物的定性、定量研究中。但是单纯的PLFA法并不能揭示特定微生物的代谢过程，无法研究特定微生物的功能。结合13C的PLFA法可以揭示微生物参与的碳循环过程，因此，可用于解决这一问题。随着质谱等相关技术的日趋成熟，13C标记的PLFA法已成为研究微生物群落功能的一种常用方法。本文通过梳理大量文献，综述13C标记的PLFA法在微生物介导的植物-土壤碳循环和某些特定微生物上的应用，并在此基础上进行展望，以期为中药生态种植的研究提供参考。

1 PLFA法简介

PLFA是构成活体细胞膜的重要组分，在自然生长状态下相对稳定，不同类群的微生物能通过不同生化途径形成不同的PLFA，部分PLFA总是出现在同一类群的微生物中，而在其他类群的微生物中很少出现[2]。由于磷脂不能作为细胞的贮存物质，一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物就会迅速分解，在细胞外环境中的PLFA量少且不稳定，因此，PLFA可以作为活体微生物的标记物[3]，用于研究微生物的种类和数量。

20世纪70年代，White等[4]开始用PLFA法对河口沉积物中的微生物进行分析。此后，国内外学者逐渐利用此法对河海沉积物[5]、土壤[6]、发酵物[7]中的微生物进行定性或定量分析。20世纪80年代，Boschker等[8]提出通过添加13C标记的生物标志物与PLFA法相结合的方法，将微生物种群与特定的生物化学过程联系起来。原则上，所有涉及生物吸收和消耗碳的过程都可以通过添加标记物的方法进行研究。将稳定同位素标记与PLFA法2种方法相结合，对研究土壤中特定有机质循环有着极为重要的意义[9]。

2 13C标记的PLFA法原理

将同位素标记后的物质添加到特定环境中，可以被微生物直接或间接吸收，然后在体内转化为可被检测的PLFA。对含有添加同位素的PLFA进行检测分析，可以得到参与代谢添加物质的微生物信息[8]。目前，最为常用的同位素标记方法是13C标记法，13C作为稳定同位素其灵敏度高且无放射性危害[10]。碳作为有机生命的主要构成元素，直接参与到所有生物的代谢活动中，因此，13C标记法还具有普遍适应性，这使得13C标记的PLFA法安全、有效且适用范围较广。13C标记的PLFA法可以将特定微生物与其功能联系起来，提供有关微生物间相互作用及其代谢功能的直接信息，并且操作简便、实验成本低，因此，该技术已被广泛应用于确认土壤微生物的生态功能、追踪碳元素在微生物群体和个体间的流动等方面的研究中[11-12]。

3 13C标记的PLFA法的应用

3.1 参与植物-土壤碳循环的微生物研究

3.1.1植物残体的微生物分解研究 植物残体是土壤有机质形成的主要母质，植物残体的分解是全球碳循环中的关键一步，并且可以为土壤微生物的生命活动提供物质和能量[13-14]。土壤微生物在植物残体的分解中具有不可替代的作用，因此，可以通过研究土壤微生物来了解植物残体的分解过程[15]。Williams等[16]在土壤中分别添加被13C标记过的绛车轴草TrifoliumincarnatumL.和1年生多花黑麦草LoliummultiflorumLam.的根及秸秆，并测量了土壤PLFA中的13C含量。发现4种处理中部分PLFA(16：1ω5和10Me17：0)中13C始终维持在很低的水平，而部分PLFA(16：0、18：1ω9和18：2ω6，9)总是含有较高比例的13C，研究表明，在土壤中存在的部分微生物负责同化残留物。Pan等[17]将13C标记的水稻秸秆及其衍生生物炭施用于水稻田中，研究其分解过程对土壤微生物群落结构和功能的影响。根据PLFA中13C数据发现，23种不同的PLFA参与分解水稻秸秆，而只有17种PLFA参与分解水稻秸秆衍生生物炭。此结论与Williams等的结论有一定的相似之处，并不是土壤中的所有微生物都参与了植物残体的分解。

残体的种类及土壤的种类、深度等性质均影响微生物对植物残体的分解。Bai等[18]在土壤中添加了3种13C标记的小麦残体(麦粒、叶和根)，利用土壤中的PLFA来描绘微生物群落的动态变化。研究结果显示，不同植物残体产生的CO2和PLFA的量有显著区别，其中麦粒最多，叶次之，根最少。Hicks Pries等[19]在不同深度(15、55、95 cm)的土壤中添加13C标记的野燕麦AvenafatuaL.根，发现30个月时，残体在15 cm的分解速度比95 cm的快。Arcand等[20]探讨长期有机管理和常规管理是否会导致微生物在小麦残渣分解上产生差异，结果发现，与常规土壤相比，有机管理土壤中真菌尤其是放线菌在小麦残渣分解上发挥更重要的作用。仇存璞等[21]也证实，土壤原有有机质可以对参与秸秆分解微生物的群落结构产生影响。

3.1.2参与土壤激发效应的微生物研究 激发效应是由于相对温和的土壤处理引起的土壤有机质周转率的强烈短期变化，这些处理措施包括施肥、根系渗出有机物质、对土壤机械处理、土壤的干燥和再湿润等[22]。土壤微生物对外源有机质输入的响应是形成激发效应的内在驱动力[23-25]，可以通过研究土壤微生物来认识土壤激发效应。Nottingham等[26]在土壤中添加13C标记的蔗糖和玉米ZeamaysL.秸秆，由PLFA(16：1ω5和16：1ω7)鉴定的某些革兰阴性细菌，在蔗糖和玉米处理中都表现出对土壤碳的吸收增加，并且可能与启动效应直接相关。Wang等[27]将13C标记的新鲜玉米叶和茎添加到土壤中，研究新鲜有机质质量的变化对土壤激发效应的影响。发现与添加茎的土壤相比，添加叶片的土壤中微生物生长更快，但是16 d后则相反。并且认为，微生物对碳和其他营养物质的需求是土壤激发效应的主要决定因素之一。Qiao等[28]借助13C标记的PLFA法发现，真菌在幼林土壤的启动效应中具有重要作用。

除了向土壤中添加植物残体可以引起土壤激发效应外，植物本身也会引起激发效应。植物根系参与的土壤有机质分解的变化，称为根际激发效应(RPE)[29-30]。Bird等[31]在1项为期2年的温室研究中，在种植裂稃燕麦AvenabarbataPott ex Link和非种植条件下，用13C标记的地下碳(根系和有机质)。实验发现，与未种植的土壤相比，活根增加了地下13C的周转率和损失，并且其中的革兰阳性菌对地下13C的长期利用得到了增强。因此认为，革兰阳性菌的活性可能是激发作用主要调控因子。Kou等[32]采用天然13C示踪剂对大豆和棉籽木3个生长期的RPE进行定量分析，使用PLFA测定土壤微生物和线虫的群落组成，并探讨其与RPE的关系。结果发现，不同生长期RPE差异较大，大豆产生的累积RPE>棉籽木，大豆处理组发现的细菌PLFA值较高，也表现出植物种类效应。分析结果表明，微生物群落的变化与RPE、土壤和植物特性密切相关，线虫群落通过改变微生物群落结构间接影响RPE。因此，根际土壤微食物网的相互作用可以调节微生物的周转或微生物群落的组成，从而调节RPE。

3.1.3促进根际碳循环的丛枝菌根(AM)真菌研究 AM是陆生高等植物的根部与真菌菌丝所形成的一种结合体，是一种共生现象[33]。AM真菌在根部定植后，寄主植物发生了深刻的生理变化，不仅可以促进寄主植物从土壤中吸收矿质元素和水分，还可以把植物中的碳传输到土壤中，并调节土壤有机质的分解[34-36]。Paterson等[37]用13CO2脉冲标记黑麦草，采用不同孔径的网格控制根系和丛枝菌根菌丝进入土壤，并定量PLFA和土壤释放CO2中的13C。证明了丛枝菌根除影响凋落物分解速率外，对原生土壤有机质的转化也有重要影响。Herman等[38]在种植长叶车前PlantagolanceolataL.的土壤中添加13C标记的长叶车前的根凋落物，研究AM真菌对凋落物分解的调节作用。结果显示，根凋落物在分解时，含有AM真菌的组中，革兰阴性菌、革兰阳性菌和AM真菌(16：1ω5c)对13C的富集程度低于不含AM真菌的处理组。这种富集现象可能是由AM真菌将植物中的13C提供到土壤微生物群落中产生，因此，这种碳输入具有可以改变凋落物分解的中介作用。

但是AM的作用会受到外来物种、水分条件等影响。Dierks等[39]在研究旱雀麦BromustectorumL.入侵对蒿属植物草原AM真菌群落结构的影响时，用13CO2脉冲标记蒿属植物，并通过含13C的PLFA来评估土壤微生物。发现旱雀麦的入侵能改变AM真菌的群落结构，降低了AM真菌的丰富度。Bao等[40]利用13CO2标记并计算水稻在不同淹水条件下向AM真菌转移的碳量。结果表明，在所有淹水条件下，均有植物同化碳转移给AM真菌，AM真菌PLFA中13C显著富集，但是随着淹水强度的增加，AM真菌中的碳转移量呈下降趋势。此外还发现，土壤中原生动物[41]、不同树种[42]、土壤氮含量[43]均对AM的作用产生不同程度的影响。

3.1.4光合作用产物的微生物利用研究 植物通过光合作用固定大气CO2，生成的部分有机物，并可以通过根部释放到土壤中。土壤中的微生物则会对这部分有机物进行分解利用，除了满足自身发育需要，还将部分有机碳以CO2的形式释放到大气中。因此，研究光合作用产物的微生物利用过程对于认识全球碳循环具有重要意义。Butler等[44]最早将13C标记PLFA法应用到植物光合作用产物的根际微生物利用研究中，并且证明了该方法的可行性。此后大量学者使用类似的方法研究光合作用产物在土壤中的循环，其中多数学者采用13CO2脉冲或连续标记，相关研究[45-46]则借助C3植物和C4植物在光合作用中对13C同化量的差异来达到标记效果。

Chaudhary等[47]采用13CO2脉冲标记柳枝稷PanicumvirgatumL.，并分析根际土壤中PLFA与根际沉积碳的结合情况。实验发现，真菌和革兰阴性菌PLFA中的13C富集速度快于革兰阳性和放线菌，但是放线菌PLFA中13C的比例随采样时间的增加而显著增加。Yuan等[48]在水稻的不同生长期进行13CO2脉冲标记，并分析了水稻根际土壤中的PLFA，发现根际土壤中真菌PLFA中13C的比例最高，放线菌PLFA的13C则是最小的。此外，还发现干旱[49]、植物种类[50]、物种多样性[51]、施肥[52-54]均会对微生物对光合作用产物的分解利用产生不同程度的影响。可能是影响因子的变化首先影响到植物释放到土壤中有机物的性质和数量，继而影响微生物对有机物的利用过程，或者是影响因子的变化直接影响到了土壤中微生物的组成。

3.2 特定微生物研究

3.2.1甲烷氧化菌 甲烷(CH4)是一种仅次于CO2的温室气体，且其温室效应能力远高于CO2。土壤中甲烷氧化菌对CH4的氧化消耗是大气CH4唯一的生物汇，甲烷氧化菌对于维持大气中CH4的浓度、降低温室效应有较为重要的意义[55-56]。因此，学者利用13C标记的PLFA法来研究了甲烷氧化菌对CH4的氧化作用。Zigah等[57]利用13C标记的PLFA法分析了基伍湖水柱中CH4氧化途径和相关的甲烷氧化菌群落。实验证明，湖水中CH4的主要氧化途径是Ⅱ型甲烷氧化菌介导的好氧氧化。一种新型的厌氧甲烷氧化古菌(ANME)而不是已知的ANME-1和ANME-2参与了CH4的厌氧氧化。Henneberger等[58]研究了垃圾填埋场覆盖土壤中活跃的甲烷氧化菌在空间和季节上的差异。实验发现，在活跃的甲烷氧化菌群体中表现出明显的空间和季节差异，并且发现Ⅰ型甲烷氧化菌特别是甲基单胞菌和甲状杆菌是CH4的主要氧化菌群。Crossman等[59]从垃圾填埋场取得的富含甲烷氧化菌的黏土和沙土，然后用13C标记的CH4进行孵育。PLFA分析后得知，黏土中甲烷氧化细菌群落随深度变化而变化，而沙土在整个深度都表现出Ⅰ型和Ⅱ型甲烷氧化菌混合。可能是沙土透气性较高，使得CH4可以渗透土壤，而黏土则限制了CH4的渗透。植物可以通过改变土壤微生物群落结构来改变土壤功能。Menyailo等[60]研究了不同树种对于土壤甲烷氧化菌的影响，发现树种改变了大气CH4氧化活性，但没有改变甲烷氧化菌的组成。Tate等[61]则指出植被、土壤质地和充水孔隙空间都会影响甲烷氧化菌对CH4的氧化，且影响这些特定生态系统中CH4吸收的似乎是多种因素的组合，而不是单个因素。

3.2.2浮游植物 浮游植物广泛分布于江河湖海中，是全球生物碳、氮、氧、硅、磷和铁的循环中心，是水体生态系统中最重要的初级生产者[62]。浮游植物作为水体其他生物的直接或间接的食物来源，是维持水体生物多样性的重要物质基础。浮游植物是水体溶氧的主要提供者，在维持大气中CO2的浓度上具有无法替代的位置[63]。同时，浮游植物对环境变化较为敏感，因此，其种类组成与优势种类群等数据可以用来监测水体环境[64-65]。13C标记的PLFA法可以用来估算特定浮游植物的产量，也可以用以研究“浮游植物-细菌”食物链。Dijkman等[66]发现，在藻类培养中，以13C标记的PLFA为基础计算生长速度，以生物量增加为基础计算生长速度时，PLFA浓度和细胞数上呈现一致性。证明可以通过藻类的PLFA来估算特异性初级产物产量。同样是在斯凯尔特河中，Boschker等[67]对河流春季繁殖期浮游生物群落结构和同位素组成进行研究，发现在河流下游的近海一侧，细菌和藻类PLFA中的同位素比值相似，表明藻类生产与有机物的细菌消耗之间存在耦合关系。然而在河流上游，与藻类PLFA相比，细菌PLFA的中13C值较高，表明该河流存在一个非耦合的藻类-细菌系统，并有陆源有机质或污水等支持细菌生长，并非藻类可以完全支持细菌的生长。De Kluijver等[68]研究CO2浓度上升对浮游植物向细菌转移碳的潜在影响。在不同CO2浓度下培养浮游植物，用含13C碳酸氢盐进行标记。利用PLFA的同位素比值来推断浮游植物和细菌的生物量和产量，发现CO2浓度升高对绿藻、硅藻和细菌的生物量有显著的正向影响，但是对浮游植物向细菌的碳转移效率没有显著影响。

4 在中药生态种植研究领域的展望

药用植物与其根际微生物联系密切，根际微生物对药用植物的生长发育、产量、次生代谢产物的积累等均具有重要影响，开展药用植物与其根际微生物的互作研究对于中药材产业的发展具有指导意义[69]。PLFA法也已经被应用到药用植物的根际微生物研究中。李建鹃等[70]利用PLFA技术研究连作木麻黄根际土壤微生物，发现随栽培代数增加，细菌含量减少，真菌含量增加。邹立思等[71]也利用PLFA技术研究4个产地太子参的根际土壤微生物，发现4个产地太子参的PLFA在种类和组成比例上存在很大的差异。目前，中药对于PLFA法在中药中的应用范围较窄，一般只是对中药材根际土壤的PLFA进行种类和数量上的差异性比较，并没有利用13C标记的PLFA法进行研究的案例。13C标记的PLFA法作为一种成熟的研究微生物动态变化的技术，在确认药用植物根际微生物的功能、筛选有益微生物、揭示药用植物-土壤-微生物关系上具有较大的优势，因此，在中药生态种植研究领域具有广阔的前景。

4.1 筛选增加药用植物抗性的AM真菌

AM作为分布广泛的植物与真菌共生体，其对植物的保护功能一直是研究的热点。现代研究表明，AM真菌可以促进宿主植物对于氮、磷等元素的吸收[72-73]，提高宿主植物的耐旱、耐盐、耐重金属的能力[74-76]。在中药材农业生产上，AM真菌可以通过增加药用植物的抗性来提高药材产量和质量[77]。

AM为植物和土壤之间的物质桥梁，连通着寄生植物和土壤微生物。使用13C标记的PLFA法可以追踪碳从宿主植物到AM真菌，再到土壤微生物的过程，并且计算出碳的转移量，能从微生物层面上揭示植物、AM和土壤微生物之间的关系。因此，13C标记的PLFA法在中药种植方面为筛选提高药用植物抗逆性的AM真菌，提高AM侵染率提供理论依据。以期通过添加有益AM真菌增加药用植物抗性，达到减肥减药、提高植物成活率、实现经济效益和生态效益的双赢的目的。

4.2 筛选缓解药用植物连作障碍的微生物

根和根茎类药材约占药用植物的70%，且绝大数根和根茎类药材存在连作障碍[78]。药用植物连作障碍可以降低种子发芽率，增加土传病害发生率，降低中药材产量和品质，阻碍中药产业的健康发展。周芳等[79]认为，植物-土壤-微生物共同作用引起药用植物连作障碍，但三者之间的内在影响机制还不够明确。根据药用植物特点开发新的微生物制剂来缓解药用植物连作障碍，对于提高药用植物产量和质量具有重要意义[80-82]。

使用13CO2对药用植物进行脉冲标记或者连续标记，并通过含13C的PLFA定位可以利用根系分泌物的土壤微生物或直接向土壤中添加13C标记的已知自毒物质，分析根际微生物的变化，找到参与代谢自毒物质的土壤微生物并通过进一步实验检验该部分微生物缓解植物连作障碍的能力。因此，13C标记的PLFA法可以为筛选有益生防菌来缓解药用植物连作障碍提供数据支持。

4.3 非药用部位堆肥还田评价

药用植物收获后的非药用部位一直是以丢弃为主，浪费资源，若处理不当还可能造成环境污染，影响人类健康。而将非药用部位堆肥还田处理，很好地解决了药用植物非药用部位随意丢弃的问题，也减少了化肥的使用，实现资源的循环利用，符合中药生态种植理念。

使用13C标记生长期的药用植物，并在收获后将非药用部位进行堆肥实验。可以通过13C 标记的PLFA找到参与腐熟的微生物群落，获得不同腐熟阶段优势菌种信息。堆肥施用后，还可通过13C标记的PLFA法检测土壤微生物的变化情况。因此，13C标记的PLFA法可以用来研究堆肥腐熟进程，调控堆肥条件，并且根据对土壤微生物群落的影响情况来评价肥料的质量。

5 结语

综上所述，13C标记的PLFA法在揭示微生物功能方面具有独特的优势。药用植物的种植与微生物息息相关，特别是药用植物生态种植领域提倡以菌治病，菌根真菌等生态农业常用技术的使用，更加注重微生物在药用植物种植中的应用。因此，使用13C标记的PLFA法揭示微生物与植物的关系，促进相关微生物技术在药用植物生态种植领域的应用，有助于推动中药产业的现代化发展。