纳米N-TiO2对口腔科环境消毒效果及抗菌机理的初探*

化萌萌 唐晓君 王亚宇 卢怡 董作青

医疗场所环境中的微生物污染问题，一直以来都对于医护人员及患者的人身健康存在重大威胁［1］。目前，医院根据环境等级分类进行消毒工作，以防止交叉感染造成的严重后果。临床上常见的消毒手段包括消毒剂（含氯消毒剂、2%戊二醛等)［2，3］，紫外线杀菌［4］，动态空气净化器［5］等。虽然这些消毒手段可对微生物起到杀灭作用，但是存在作用时间短、对人体有伤害［6］等问题。因此需要一种能够安全长效发挥抗菌作用的抗菌剂。

纳米TiO2以其光催化活性高及强氧化分解能力等特点而受到关注［7，8］。研究表明，在口腔种植体表面加入改性纳米TiO2涂层后，对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的杀菌率可达95.29%，具有良好的抗菌效果［9，10］。然而，纳米TiO2也存在一定的局限性。由于其禁带宽度较大，需要紫外光辅助才能完成反应。为此，本研究团队前期［11］使用氮掺杂技术，完成了高可见活性纳米N-TiO2喷剂的规模化制备及应用，其在室内自然光下就能直接将光能转化为化学能。并研究了其对医疗环境中物体表面的常见病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及白色念菌株的抗菌性能检测，已证实具有良好的灭菌效果［12］。现将纳米N-TiO2喷剂用于口腔科临床环境中，并与临床上常用消毒剂健之素进行对比，以期研究其在实际临床情况下的抗菌性能，并对其抗菌机理进行初探。

1.研究对象与方法

1.1 研究对象 北京市某三甲医院口腔科诊室中选取牙片室、消毒室和打磨室三种诊室作为实验场所，室内温度控制在22～26℃，湿度50%～65%。每间诊室工作人员1名，工作时间严格限制其他人员出入。

1.2 实验材料及设备 纳米N-TiO2喷剂（分散剂有效含量为6%、粘度为2mpa·s，质量分数1wt%，平均粒径＜65nm，相对密度3.8-3.9g/cm2，pH=7-8；北京科技大学提供)；0.9%无菌生理盐水；健之素消毒剂（其主要成份为三氯异氰脲酸钠速溶泡腾制剂，每片含有效物250mg，北京长江脉医药科技有限责任公司）。

荧光灯（D50），色温5000K，显色指数大于90%，波长分布在400～780nm。

1.3 实验分组在每个场所选取15个大小约10cm×10cm的物表，随机分为实验组（使用纳米N-TiO2进行喷涂，5个），阳性对照组（使用健之素消毒剂进行喷涂，5个）；阴性对照组（使用0.9%无菌生理盐水进行喷涂，5个）。

1.4 实验菌株和培养基 大肠埃希氏菌（CGMCC 1.3373)，培养基为LB培养基

1.5 方法

1.5.1 纳米N-TiO2喷剂消毒效果的检测

(1）采样按照《医院消毒卫生标准》(GB 15982-2012）对实验物表进行采样。采样方法：用5cm×5cm的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，用沾有无菌生理盐水的无菌棉拭子在规格板内均匀涂擦10次转动采样，将被污染部分剪下，其余投入2mL灭菌生理盐水试管中立即送检，并进行菌落计数（CFU/cm2)。

采样时机：选取下午5点口腔科诊疗结束后，采样前，关闭门、窗，在无人走动的情况下，静止10min后进行采样。实验组和对照组均连续取样5天。

(2）消毒方法模拟室内自然光照：打开荧光灯（D50），稳定0.5h以上，然后调节荧光灯高度或功率来调节光照强度，采样照度计测量，记录测量用光照强度（1000～1500lx），偏差不超过2%。

首先对实验物表进行物理清洁，然后通过喷涂工艺（压力0.7MPa，喷枪口径0.5mm，喷涂时间15s）进行物表消毒。其中，实验组用纳米N-TiO2喷剂进行喷涂消毒，阳性对照组使用健之素进行喷涂消毒，阴性对照组使用0.9%无菌生理盐水进行喷涂。各组喷涂消毒时间5min。按照上述采样方法进行细菌培养与计数。

为避免研究的偏倚，本研究的所有操作和实验处理均由经过培训的同一个人完成。

(3）评价标准按照《消毒技术规范》［13］的要求，口腔科环境分类为Ⅳ类环境，要求消毒后环境细菌总数≤10.0 CFU/cm2。

(4）统计学分析用SPSS软件22.0版本进行统计学分析，采用χ2检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。

1.5.2 纳米N-TiO2喷剂抗菌机理的初步观察

为了研究抗菌喷剂的抗菌机理，在100mL浓度为106cfu/mL的大肠杆菌中加入0.1g纳米N-TiO2喷剂，然后进行自然光照。在不同光照时间下取出一定量的菌液，进行乙醇脱水，制备样品进行扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM)，通过观察大肠杆菌的形貌来研究其杀灭过程。

2.结果

2.1 纳米N-TiO2喷剂消毒效果的检测

2.2.1 三种方法对实验物表消毒前后的细菌菌落数结果比较（表1，2）在进行消毒前，口腔科各诊室物表存在污染，细菌菌落数均值分别为牙片室279±11.6(CFU/cm2)，消 毒 室197±10.3(CFU/cm2)，打磨室268±12.1(CFU/cm2)；实验组（纳米N-TiO2组）在消毒后各诊室实验物表的细菌菌落数均值分别为3±1.3(CFU/cm2)，3±0.9(CFU/cm2)，4±0.7(CFU/cm2)，杀菌率为100%，与消毒前差异有明显统计学意义（P＜0.01)；阳性对照组（健之素组）在消毒后各诊室实验物表的细菌菌落数均值分别为36±4.7(CFU/cm2)，24±1.3(CFU/cm2)，39±3.2(CFU/cm2)，杀菌率为88.7%，与消毒前差异有明显统计学意义（P＜0.01)；阴性对照组（0.9%无菌生理盐水）各诊室的实验物表细菌菌落数 均 值分 别为267±11.8(CFU/cm2)，189±11.7(CFU/cm2)，269±10.0(CFU/cm2)，与消毒前物表菌落数无明显差异（P＞0.05)。

表1 三种方法喷涂后口腔各诊室物表的细菌菌落数（X±S）

表2 口腔各诊室物表喷涂纳米N-TiO2前后的细菌菌落数（±S)

表2 口腔各诊室物表喷涂纳米N-TiO2前后的细菌菌落数（±S)

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2.1.2 纳米N-TiO2喷剂对实验物表消毒后其表面细菌菌落数的日间变化（表2）口腔科各诊室实验物体表面喷涂纳米N-TiO2后，其表面细菌菌落数均数的日间差异不显著，P＞0.05。

2.2 纳米N-TiO2喷剂抗菌机理的初步观察

2.2.1 大肠杆菌在使用N-TiO2喷剂杀菌过程中的SEM观察 图1为未经处理的大肠杆菌原始形貌，可知，未经处理的大肠杆菌菌体呈两端钝圆的直杆状，长度在0.5-1.5μm之间。视野中的菌体结构均比较完整，饱满无损伤。

表2 喷涂纳米N-TiO2后实验物体表面细菌菌落数值（X±S）的日间比较

在经5min光催化杀菌处理后，部分菌体的局部出现变形（图2)；15～30min后，大部分细菌出现了不同程度的结构变形，主要体现为局部皱缩与凹陷（图3)；60min后发现，视野中所有细菌基本都出现了较为明显的变形，菌体表面出现了开放性的破损与孔洞，细胞外层结构被破坏，部分细菌的结构已完全崩塌（图4)。

图1 大肠杆菌原始形貌

图2 光照5 min后的大肠杆菌形貌

图3 光照15 min、30 min后大肠杆菌的形貌

图4 光照60 min后大肠杆菌的形貌

2.2.2 大肠杆菌在使用纳米N-TiO2喷剂杀菌过程中的TEM观察 图5(a）为未经处理的大肠杆菌透射电镜图，可观察到完整、光滑的的细胞壁与细胞质膜结构，周质间隔紧密，胞浆均匀分布。经5min光催化杀菌后，部分细菌内部出现了一些浅灰色区域，如图5(b)。15min后可见图5(c）中浅灰色区域周围的细胞外层细胞壁与膜结构出现了明显的不连续区段。图6(a)(b）为光催化处理30min与60min的部分大肠杆菌样品，可观察到有部分细菌的胞内物质紊乱或已完全消失。

图5 (a）大肠杆菌原貌；(b）光照5 min后大肠杆菌形貌；(c）光照15 min后大肠杆菌形貌

图6 (a）光照30 min后大肠杆菌形貌；(b）光照60 min后大肠杆菌形貌

3.讨论

医院感染控制一直以来都是关注的热点问题。据WHO统计数据表明，全球60亿人口中，每年大约3亿人因病住院治疗。其中，平均8.7%的住院病人发生了不同严重程度的医院感染［14］。如何对医院环境及物表进行有效消毒，是杜绝院内感染的重中之重。目前医院的消毒灭菌手段主要有：物理灭菌法（压力蒸汽灭菌、紫外线消毒、臭氧消毒等）和化学灭菌法（各种化学消毒剂：醛类、过氧化合物类、醇类消毒剂、含氯及含碘消毒剂等）两大类［15］。但这些现有消毒手段也存在一些局限性，如消毒效果的长效性难以保持，一旦停止消毒，环境中的病原菌数量很快回升［16］。化学消毒剂在消毒过程中对设备、器械等有腐蚀性，易分解、产生二次污染。此外，有些病原菌等微生物在对抗消毒剂过程中形成生物被膜，从而阻挡或排除消毒剂分子，最终导致消毒剂失活［17］。

纳米TiO2抗菌剂以其抗菌谱广，无污染等特点近年来成为学者的研究重点。纳米TiO2在光的激发下，产生电子和空穴，把光能转化为化学能，自身不被消耗，具有长效性的特点［7，8］。国内外相关研究表明：光催化纳米TiO2对革兰阴性菌，革兰阴性菌，丝状菌和单细胞真菌等都有很好的杀灭效果［18］。但TiO2的禁带宽度为3.2eV，处于紫外区，只有在紫外光下才能发挥抗菌作用。本课题组通过同步晶化与氮掺杂技术，以无机助剂为分散系成功制备出了纳米N-TiO2喷剂，突破了只能利用紫外光的局限性。通过对医院口腔科常见微生物进行调查，已证实纳米N-TiO2对医院常见致病微生物有较好的抑菌效果［12］。并已对医院诊室空气消毒进行了初期研究［19-21］。

为进一步应用于医院临床实际环境中，本研究选取口腔科牙片室、消毒室和打磨室三种诊室作为实验场所，使用纳米N-TiO2喷剂对实验物表进行喷涂消毒，同时选用临床上常用消毒剂健之素作为对照组。可知，在进行物表消毒前，口腔科各诊室物表存在污染，消毒后，实验组各诊室实验物表的细菌菌落数均值分别为3±1.3(CFU/cm2)，3±0.9(CFU/cm2)，4±0.7(CFU/cm2)，杀 菌 率 为100%，与消毒前差异有明显统计学意义（P＜0.01)；阳性对照组各诊室实验物表的细菌菌落数均值分别为36±4.7(CFU/cm2)，24±1.3(CFU/cm2)，39±3.2(CFU/cm2)，杀菌率为88.7%；阴性对照组各诊室的实验物表细菌菌落数均值分别为267±11.8(CFU/cm2)，189±11.7(CFU/cm2)，269±10.0(CFU/cm2)。说明纳米N-TiO2喷剂消毒效果优于健之素。

通过连续5天动态监测结果可知，各诊室实验物体表面喷涂纳米N-TiO2后，其表面细菌菌落数均数的日间差异不显著（P＞0.05)。在检测次数内，口腔科实验物表的菌落数均达到标准值（10cfu/cm2)。说明，在口腔科实际环境中纳米N-TiO2喷剂具有良好的应用前景。

为了研究抗菌喷剂的抗菌机理，本研究以医院环境中较常见的病原菌大肠杆菌为例，通过观察其形貌变化来研究纳米N-TiO2喷剂的灭菌过程。

SEM观察可知，在光催化杀菌过程中菌体发生了较大的形态改变。这是由于纳米N-TiO2喷剂在光照下产生的羟基自由基、超氧自由基、双阳水等活性氧物质攻击细菌，使构成细菌细胞壁和细胞膜的有机物受到氧化。随着光催化处理时间的增长，观察到菌体表面出现了开放性的破损与孔洞，细胞外层结构被破坏。部分细菌的结构已完全崩塌。结合图1-4可认为细胞内部物质出现了聚缩或流失，从而在制样脱水与干燥过程中使得细菌出现皱缩与凹陷。反应过程中外层细胞壁与膜结构由完整到逐渐分解破损，并最终解体。

TEM观察可知，在纳米N-TiO2抗菌喷剂光催化杀菌过程中，细胞壁与细胞膜结构受到活性氧基团的氧化攻击，细胞的屏障结构破坏，通透性发生改变，胞内K+等流失，环境中的活性氧集团与一些其他离子可进入细胞内进行进一步的反应。当细胞表面出现较大的破损时，细胞内大分子物质及内容物流失。

本次实验以口腔科诊室环境作为研究对象，进行了可见光催化纳米N-TiO2喷剂抗菌材料在医院实际环境消毒效果的评价研究，可知消毒效果显著，初步建立了纳米N-TiO2喷剂在医院环境消毒的应用方法。但是作为一种新型抗菌剂，目前还未处于研究阶段，能否广泛应用于医院中其他科室环境，还需进一步扩大实验范围；此外，能否实现全天候条件下的抗菌效果，还需将喷剂与其他抗菌材料复合得知。