转基因植物疫苗应用于口服免疫途径的新进展

王 真，李小兰，刘建国

(1.遵义医科大学 口腔医学院，贵州 遵义 563099；2.南充市中心医院 口腔科，四川 南充 637000；3.遵义医科大学 贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室，贵州 遵义 563006)

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)自2019年12月中下旬爆发以来，引起了世界范围的大流行，截至2020年11月，全球范围内确诊人数超过6 000万。因此，针对新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)疫苗的研发备受关注，据WHO统计，现已有156种候选疫苗得到动物试验和人体试验的数据支持，在临床中或即将进入临床开发阶段[1]。传统疫苗主要由灭活或减毒的病原体组成[2]，通过注射给药的方式，引发机体的体液免疫和细胞免疫，已成功地减少了白喉、破伤风、乙型肝炎等传染原相关的疾病传播[3]。但在经济条件相对落后的发展中国家，传统疫苗在生产、运输和储藏上的高成本，医务人员的缺乏严重制约了它的推广使用。转基因植物疫苗可通过口服免疫途径递送抗原，在疫苗的开发和推广上具有巨大的优势。我们将基于植物的可食用疫苗在口服免疫途径的最新研究进展和主要优势进行综述。

1 以M细胞为核心的胃肠道粘膜免疫机制

口服免疫途径主要促进胃肠道的粘膜免疫，与外周淋巴组织相比，胃肠道粘膜淋巴系统有两个方面的特点：①解剖特征上具有特征性的抗原摄取机制，如微皱褶细胞(Microfold cell，M细胞)和派伊尔集合淋巴结(Peyer’s patches，PP)；②拥有大量活化的T细胞和记忆细胞，并大量启用分泌型IgA(SIgA)为其效应机制。因此，构建能够有效激活特异性SIgA和系统IgG的平台，是提高口服疫苗效力的关键。

在胃肠道免疫系统中，孤立淋巴滤泡(ILF)、PP和肠系膜淋巴结(MLNs)作为诱导部位，而上皮内淋巴细胞(IEL)和粘膜固有层(LP)构成效应部位[4]。通常认为抗原是通过以下几种可能的途径进入肠粘膜诱导免疫发生：①抗原通过卵泡相关上皮(FAE)衬里PP中的M细胞进入肠道免疫系统，再将抗原传递给FAE下的潜在树突状细胞(DCs)[5]；②DC通过树突样的结构延伸至肠腔上皮细胞的紧密连接处，直接摄取抗原，但这种摄取途径，在以小鼠为模型的动物实验中似乎局限于某些表达趋化因子受体CX3CR1的DC群体[6]；③卵泡相关上皮的基底表面具有表达MHC Ⅱ的肠细胞，可充当局部抗原提呈细胞(APC)，某些抗原可移位到卵泡相关上皮的基底层并递送到底层DC[7]。

PP由含B细胞丰富的滤泡组织和含T细胞的滤泡间区组成，被认为是GALT中最大的淋巴组织之一。它受到富含M细胞的卵泡相关上皮的保护，M细胞可以从肠道摄取和运输抗原片段[8]。M细胞的特殊构造是抗原进入肠道粘膜系统的主要入口。目前许多课题组都正在积极探索针对M细胞的主动靶向机制，以便有效地将抗原传递到PP，激活胃肠道粘膜免疫应答。

1.1 针对M细胞表面受体的研究 微皱褶细胞(Microfold cell，M细胞)是GALT中的特有细胞，并表达独特的碳水化合物受体，这些受体为粘膜疫苗的运输提供了选择性的靶标，在研究靶向抗原递送中，M细胞顶端表面上的特异性受体成为研究的重点。凝集素由能够可逆性结合特定碳水化合物残基的蛋白质和糖蛋白组成。荆豆凝集素1(UEA-1)能靶向结合在M细胞上顶端表达的α-L-岩藻受体。与普通抗原颗粒相比，口服用UEA-1修饰的抗原颗粒进行的免疫接种可以显著提高SIgA 的分泌[9]。另外，细胞因子IL-2和IFN-γ的大量增加还表明有凝集素修饰的抗原颗粒显示出更强的细胞免疫性。这些结果表明针对凝集素的策略可能会改善粘膜免疫反应。但是，某些凝集素是有毒的，可能具有固有的免疫原性。使用凝集素作为粘膜佐剂在刺激免疫方面可能是有利的，但也可能引发针对凝集素的免疫反应，最终可能阻止抗原的摄取[10]。

其他的在M细胞上表达的蛋白质受体也被用于靶向递送的研究。例如，存在于多种细胞外基质中的RGD序列，是一种由精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸组成的肽段，可与11种整合素特异性结合，能有效地促进细胞对生物材料的粘附。在M细胞顶端常过度表达β1整合素，RGD已被用作靶标，向M细胞介导的转运，以降低所需抗原剂量增加体液免疫反应。密封蛋白4是在M细胞中高度表达的紧密连接的跨膜蛋白，在设计抗原时也可以与其靶向结合，以介导增强SIgA的反应[11]。此外，如Nochi等所证明，新型单克隆抗体(NKM 16-2-4)可以将M细胞与杯状细胞区分开来，从而获得了一种能够防御致命攻击的高效疫苗[12]。

1.2 从肠道病原体的研究中得到的启示 肠道病原体可以利用自身表达的细菌粘附素或者病毒蛋白毒素，与M细胞表面的受体特异性结合，利用M细胞获得进入宿主的能力。I型鞭毛细菌(大肠杆菌，耶尔森氏菌，沙门氏菌等)的细胞外膜成分中所包含的FimH，可以与人和小鼠的M细胞表面的受体糖蛋白2(GP2)结合，病原体可以通过与M细胞的结合躲避由M细胞介导的细菌转胞作用以及之后诱导的粘膜免疫反应[13]。同时，耶尔森氏菌还可通过M细胞顶端过表达的β1整合素结合入侵宿主细胞，根据耶尔森氏菌的特征开发重组细菌菌株，已被用于疫苗开发的相关研究[14]。

霍乱弧菌所含有的霍乱毒素B亚基(CTB)是一种高效的载体分子，具有良好的免疫原性，能与大多数哺乳动物细胞表面的神经节苷脂GM1特异性结合[15]。CTB是由五个相同的多肽单体组成的稳定的五聚体，最多可结合五个GM1。结合后的CTB融合蛋白可能通过两种途径将抗原蛋白转运到肠上皮细胞中：逆行运输和转胞吞作用。通过逆行运输，携带抗原的CTB融合蛋白被回收入细胞内，到达包括高尔基体和内质网在内的运输网络中，融合蛋白降解，将抗原蛋白释放到细胞质中[16]。部分GM1受体带有短酰胺或不饱和脂肪酸链的神经酰胺结构域，可以通过转胞吞作用直接穿过极化的上皮细胞。

Limaye等首次证明了植物中产生的CTB融合蛋白能以口服途径递送至胃肠道粘膜[17]。在给小鼠饲喂表达霍乱毒素B亚基-绿色荧光蛋白(CTB-GFP)的植物细胞后，荧光显微镜检查显示GFP被递送至小鼠的小肠上皮细胞和M细胞，以及肠粘膜和粘膜下层，并且肝细胞和脾细胞中都存在GFP，这表明口服该融合蛋白可成功地通过肠腔。CTB融合蛋白可被弗林蛋白酶分解，可确保CTB会在目标抗原被摄取吸收后依然保留在上皮细胞中。该方案已经成功地应用于多种抗原或者治疗性蛋白质的实验中，实验结果显示，在口服后2～5 h内，在某些情况下最快可以在口服后30 min内在小鼠血液循环中检测到目的蛋白[18]。

尽管已证明靶向针对M细胞的免疫策略在动物模型中有效，但如何将小鼠模型的实验结果转化为人类细胞的研究中，以及如何确保免疫结果为诱导免疫应答而非免疫耐受，还需要进一步的研究。将HT29-MTX粘液分泌杯状细胞作为M细胞的体外培养模型是一个极具潜力的新进展，该模型可以更好地阐明抗原跨M细胞转运的机制，加速对M细胞特异性受体的鉴别[19]。

2 口服疫苗开发的限制条件

口服给药代表了目前治疗药物使用的金标准，是最理想和病人最能接受的给药途径[20]。口服免疫途径是指将疫苗以口服的递送方式，通过肠道相关淋巴组织(GALT)进行抗原提呈，经过不同的免疫通路产生与常规注射类似的免疫反应。相较于注射等其他疗法，口服给予了患者自行给药的机会，改善了病人的依从性。不过，由于胃肠道系统存在的多种理化障碍和生物学障碍，目前只有少量的口服制剂疫苗投入临床使用。究其原因，疫苗通过口服免疫诱导强有力的保护性免疫反应需要满足以下条件：①将完整的活性抗原传递到肠道；②通过肠道黏膜屏障；③激活肠道粘膜的抗原提呈细胞[21]。然而，胃肠道复杂的理化环境让以上的每一个条件都困难重重，在通过恶劣的胃环境并避免抗原被降解后，还需要足够的剂量来激发机体免疫。这些都严重的限制了口服疫苗的大规模开发。

2.1 基于载体开发的口服疫苗设计思路 在口服疫苗的设计上的主流思想主要为以下三个：①使用合适载体载荷抗原。满足条件的载体必须能够有效的保护所载荷的抗原，并能够在停留小肠的时间内释放疫苗，使抗原被提呈细胞(APC)提取跨越上皮层，才能够达到稳定有效地传递抗原的目的。②加入佐剂或者改善抗原的存在形式使其具有一定的佐剂作用。如果载体本身具有一定的佐剂能力最佳，可以增强疫苗所激发的免疫应答[22]。③在不改变抗原活性的前提下，进一步增加抗原的免疫原性。关于运载工具的研究，主要集中在3种不同类型的载体上：基于颗粒的载体、腺病毒载体和基于脂质的载体技术[23]。这些载体中的每一种都有不同的方法来提高抗原在其给药时的功效。聚合物微颗粒(MPS)和纳米粒子(NPs)作为颗粒类的抗体被广泛应用于疫苗载体的开发。因为聚合物颗粒能为所载荷的抗原如蛋白质、DNA和多糖成分等提供有效的保护，防止抗原稀释到胃肠道巨大的表面积上。颗粒除了结构的稳定性外，还可以控制释放部位，以改善稳定抗原的传递。携带着抗原的纳米粒子已证明可有效提高抗原的免疫原性，通过被动或主动的移动被APC摄取，以刺激细胞免疫和体液免疫反应[24]。

2.2 转基因植物疫苗的优势 植物细胞天然的细胞壁和独特的颗粒样蛋白存储器等结构刚好契合了口服疫苗载体的设计思路，在疫苗开发中具有巨大的潜力。1992年Mason等就提出了转基因植物疫苗的概念，同时证明了植物细胞能够对外源蛋白质在细胞内的进行正确的折叠和组装[25]。已经有部分实验在动物模型中测试了转基因植物细胞所产生抗原的免疫原性[26]。转基因植物疫苗在口服途径上的优势主要体现在以下三点：①植物细胞的细胞壁的可以一定程度的保护抗原——也就是通常所说的“生物封装效应”——在通过胃液消化之后依然保持疫苗成分的结构完整性，在到达小肠后，植物细胞壁被肠道寄居的微生物分解后，抗原才开始大量释放。生物包封效应降低了抗原的降解量，增加了GALT对抗原分子的生物利用度。②在植物中，尤其是在谷类作物种子中，存在着许多天然的颗粒样蛋白存储器，如淀粉颗粒和蛋白质体等。蛋白质体聚集了大量的重组融合蛋白[27]，这些植物颗粒具有类似佐剂样作用，可提高抗原的摄取率。而颗粒形式的抗原通过增强B细胞受体交联来促进更高水平的B细胞活化和内化抗原靶向溶酶体，将抗原更有效的递送给APC[28]。③蛋白质糖基化的差异。聚糖可以调节蛋白质中的免疫原性活性，植物细胞与哺乳动物系统相比具有更大的差异糖基化，因此植物来源的抗原可能显示出与其天然对应物更强的免疫原性。事实上，这对于激素和抗体类的药物是不希望有的特性，因为它会干扰所得药品的相关活性。然而，在当作疫苗使用的情况下，植物聚糖可以增强巨噬细胞等对抗原的摄取，并可使抗原体现出更好的免疫原性[29]。

2.3 转基因植物疫苗的局限性 不能精确地控制植物中转基因的表达水平，是转基因植物疫苗在投入临床应用之前存在的一项挑战。目的蛋白质在植物果实或者叶片中的浓度存在着巨大差异，这会在后期的食用时具体的用量上造成困扰。因为低剂量可能无法诱导足够的免疫反应，高剂量可能导致免疫耐受。虽然，目前可采用冷冻干燥方法来稳定植物生物质，浓缩抗原并通过以干燥生物质重量定量抗原来获得精确剂量，以及在疫苗制剂中掺入适当的佐剂来促进免疫应答规避免疫耐受[30]。但是这与植物疫苗直接口服的目标还相距甚远。

转基因植物授粉期间的遗传污染所引起的生态安全问题，也是当前研究中的另一项挑战。迄今为止，疫苗抗原已被转化到许多可食用的植物，包括生菜、番茄、马铃薯、木瓜、胡萝卜、藜麦和烟草[31]。因此除了核基因组转化之外，通过基因枪轰击的方法将外源基因植入叶绿体基因组中作为新的替代技术出现了。叶绿体基因的严格的母系遗传模式(即由细胞核外的染色体控制的遗传现象)可以避免植物授粉期间的遗传污染并消除转化过程中的基因沉默。并且，叶绿体中外源基因具有较高水平的表达(可达总可溶性蛋白(TSP)的70%)[26]，而且，将疫苗抗原掺入叶绿体基因组中还可以使多个基因在单个操纵子中表达，这意味着开发叶绿体多价疫苗具有非常大的潜力。然而，转入叶绿体基因组的方法也存在一些不利于其应用的缺点。首先，叶绿体不适用于需要糖基化以及适当的蛋白质折叠的抗原。其次，抗原表达在植物叶片中主要是不稳定的瞬时表达[32]。因此，在这方面还需要更进一步的研究。

2.4 与传统疫苗的联合使用 口服植物疫苗不仅可以单独使用引起机体免疫反应，也可与常规疫苗联合使用，并通过调节常规疫苗的剂量和给药方式，获得不一样的免疫效果。“初免-加强”的免疫方案的相关研究已证明可发挥出了较好的效果。即用常规疫苗或植物制备的纯化抗原进行胃肠外免疫的方式引发免疫反应，再通过较少的植物制剂口服后加强免疫应答。有学者已经在小鼠中评估了一种针对麻疹的口服植物疫苗，将其与相关的DNA疫苗组合应用于初免-加强方案，发现用DNA疫苗引发的小鼠免疫后，再口服表达抗原的生菜冻干叶片加强免疫后，所显示抗原特异性IgG滴度比单纯使用DNA疫苗免疫的结果增加10倍[33]。此外，在灭活的脊髓灰质炎疫苗(IPV)诱导后，将基于脊髓灰质炎VP1蛋白转基因烟草生产的疫苗，作为实现有效粘膜免疫的方法，来加强免疫效果[34]。具体实验方案为，在皮下给予IPV引发免疫的小鼠后，将以皂苷和角鲨烯作为佐剂的植物VP1疫苗，通过口服途径提供短期加强，以诱导高度特异性粘膜免疫和全身性抗体免疫应答。随后每月口服植物疫苗加强，持续6个月，然后在1年后再单次加强。实验结果表明，用植物制造的VP1疫苗可以产生IPV所不能诱导产生的粘膜免疫应答，并诱导产生了持久有效的高水平的抗VP1-IgG、IgA和中和抗体滴度。

3 展望

新型冠状病毒肺炎是全球关注的问题，接种疫苗是控制该病传播的最有效的策略。截止2020年11月，我国已有13个针对新型冠状病毒疫苗进入临床试验，其中共有4个疫苗进入Ⅲ期临床试验，共接种约6万名受试者[35]。实际上，大多数病原体都是通过粘膜感染机体的。通过注射给药的方式，在免疫方面具有一定的局限性。注射的疫苗不能够引起粘膜反应，而且它所激活的体液免疫与全身免疫力密切相关，这也就表明无法在感染的早期阶段阻止病原体入侵。随着对能够触发GALT并引起粘膜和全身体液免疫反应口服疫苗研究的深入，许多临床前研究和一些有前途的临床试验正在广泛开展。像嵌合抗原受体等用于替代传统抗生素和抗病毒药的新方式，正在全世界各个实验室努力研发中[36-37]。

转基因植物疫苗的开发虽然具有巨大潜力，但目前FDA尚未批准可食用疫苗用于接种。需要更加详细深入研究来剖析植物疫苗相关免疫原性的具体机制，以及更多的实验来优化疫苗制剂的设计。随着转基因技术以及相应的检测手段的优化，转基因植物疫苗和抗体在工业化生产中具有广泛的前景，而相关技术的进步也将有助于人们对转基因植物疫苗进一步运用于人类疾病的防治。