外泌体改善心肌缺血再灌注损伤的作用机制研究进展

李 胜，李 澜，郭 蕊，樊官伟，2

外泌体是直径为30～100 nm并具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡。1981年，Trams 等[1]在体外培养的绵羊红细胞上清液中发现了有膜结构的小囊泡，并命名为外泌体。当时推测外泌体的作用为细胞排泄废物的一种方式。随着外泌体的研究日益增多，研究者发现其在机体免疫应答、细胞分化、抗原呈递、肿瘤发生发展等各种生物过程中起作用[2]。目前的主流观点认为，外泌体的形成过程为：细胞膜内陷，形成内体，再形成多泡体，最后分泌到胞外成为外泌体。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，同时外泌体也广含核酸[microRNA(miRNA)、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等]、蛋白质、脂质等，其表面标志物主要有CD63、CD81、CD9、ALG-2 互作蛋白 X(Alix)、肿瘤易感基因 101(TSG101)、热休克蛋白27(HSP27)等。目前对于外泌体的鉴定主要有4种方法：透射电子显微镜、Nanosight、免疫印迹、流式细胞术[3]。关于外泌体的分离方法主要有基于差速离心的分离技术、基于大小的分离技术、基于免疫吸附的分离技术、沉淀法、基于微流控的分离技术[4]。

1 心肌缺血再灌注损伤机制

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球死亡和致残的主要病因，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)应用于ST段抬高型心肌梗死病人所表现出的缺血性损伤是及时而有效的，但心肌再灌注本身可能进一步导致心肌细胞死亡故而加重心肌损伤，这种现象称为心肌缺血再灌注(myocardial ischemia reperfusion，MIR)损伤[5]，因此，再灌注被描述为“双刃剑”[6]。MIR损伤是心血管疾病病理学的核心，由多种因素介导，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生增加，尤其是在再灌注过程中，造成氧化应激损伤，而还原酶Ⅱ(NADPH)氧化酶同源物家族的线粒体呼吸链和NADPH氧化酶是心肌细胞中活性氧的主要来源[7]。细胞凋亡也可导致MIR损伤，但可能是通过对非心肌细胞的作用引起的，通过凋亡和坏死引起的心肌细胞死亡也是心力衰竭发病机制中的重要组成部分，并由死亡受体和线粒体信号传导介导[8]。另外，在MIR后的缺血期，局部缺血抑制脯氨酰羟化酶活性导致细胞缺氧和炎症信号级联反应的翻译后激活，控制缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)和核转录因子-κB(NF-κB)的稳定性增加血管通透性、引发炎症反应，再灌注期间补体系统激活，白细胞与内皮细胞之间的黏附和血小板与白细胞的聚集加重了微血管功能障碍[9]。

2 外泌体的功能

细胞间的通讯是各种生理和病理过程所必需的，累积的证据表明细胞除了释放可溶性因子外，还可以通过外泌体进行通信[10]。外泌体作为细胞间通讯的信使在细胞之间传递各种信号分子，尤其是蛋白质、mRNA和非编码RNA，其中最值得注意的是miRNA。Valadi等[11]报道miRNA可以通过外泌体在细胞之间转移，细胞释放的外泌体中miRNA与相关媒介共同循环到达邻近细胞和远处的细胞，miRNA被递送至受体细胞后发挥功能性作用，尽管不能完全排除其他外泌体内容物对受体细胞的影响，但miRNA被认为是外泌体中关键的功能元件。近年来，外泌体作为多种细胞[如心脏祖细胞、间充质干细胞、内皮细胞、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)等]的旁分泌因子成为各种疾病模型的研究热点，并被认为是再生医学中最有希望的治疗策略之一[12]。文献证实外泌体作用于心肌MIR损伤模型具有抗氧化应激、抗心肌细胞凋亡、抗炎、促血管新生以及修复心肌损伤等功能[13-17]。外泌体改善MIR损伤的机制如下。

2.1 抗氧化应激 有研究表明，再灌注损伤的关键特征为三磷酸腺苷(ATP)/NADH的丧失、氧化应激的增加和细胞死亡，这是由缺血再灌注心肌的蛋白质组学缺陷所导致[15]。脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells，ADMSC)外泌体通过补充MIR损伤丢失的氧化磷酸化途径中的关键酶来恢复生物能以减少氧化应激诱导的心肌细胞凋亡[18]。间充质干细胞外泌体可增加ATP水平，减少氧化应激并激活PI3K/Akt途径以增强心肌活力防止MIR后的心脏重塑[19]。诱导多能干细胞外泌体/微囊泡通过受Nanog和缺氧诱导因子-1α调控的miR-21和miR-210抑制Caspase 3/Caspase 7的激活，从而保护H9C2细胞免受H2O2诱导的氧化应激[20]。由此可见，外泌体通过升高ATP水平、抑制凋亡途径从而减少MIR的氧化应激反应。

2.2 抗心肌细胞凋亡 间充质干细胞来源的外泌体增强心肌细胞H9C2缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型的细胞活力，降低细胞凋亡和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)水平，降低LC3-Ⅱ/Ⅰ比例并增加p62的表达，从而抑制自噬并上调离体大鼠MIR模型的Bcl-2和mTORC1/p-4eBP1信号通路，下调Traf6减少MI/R诱导的细胞凋亡和自噬[21]。Wang等[22]采用H2O2和CoCl2处理新生大鼠心肌细胞模拟体内MIR损伤诱导的细胞凋亡并建立大鼠MIR模型，结果显示外泌体携带miR-126靶向ERRFI1减少细胞凋亡和活性氧的积累从而改善心功能。远程缺血预处理(remote ischemic preconditioning，RIPC)诱导的大鼠血浆外泌体可以通过旁分泌方式转移miR-24下调H2O2处理的H9C2细胞表达，减少大鼠MIR模型中心肌细胞的凋亡，缩小梗死面积并改善心脏功能[23]。Cui等[24]研究发现ADMSC可能通过激活Wnt/-catenin信号通路拮抗MIR和H/R诱导的心肌细胞凋亡。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)外泌体调控miR-486-5p激活PI3K/Akt信号通路抑制H/R模型和MIR模型中受损心肌细胞的凋亡[16]。另有实验研究证实，骨髓间充质干细胞外泌体携带miR-125b靶向SIRT7下调Bax、Caspase-3凋亡相关蛋白和白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)炎性因子水平，并上调Bcl-2表达，以减轻MIR大鼠心肌组织的病理损伤[25]。因此，外泌体大多通过抑制凋亡级联反应保护心肌细胞而改善心脏功能。

2.3 抑制炎症反应 大鼠M2型巨噬细胞外泌体携带miR-148a下调硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)的表达并使Toll样受体4 (TLR4)/NF-κB/NLRP3炎性体信号通路失活以减轻MIR损伤[26]。间充质干细胞外泌体调控miR-182靶向TLR4/PI3K /Akt/信号通路促进巨噬细胞的M2型极化，从而减轻炎症反应、缓解心肌MIR损伤[13]。另有实验表明，间充质干细胞外泌体传递的miR-181a可能通过c-Fos抑制炎症反应并促进Treg细胞的极化保护MIR损伤后的心脏[27]。ADMSC靶向PI3K/Akt/GSK3β、pm-TOR/p-AMKP和NF-κB信号通路抑制内在细胞应激反应和炎症保护心脏免受MIR损伤[28]。此外，从大鼠和健康志愿者中分离和表征血浆外泌体并用于离体，体内和体外MIR或H/R模型验证了血浆外泌体通过热休克蛋白70(HSP70)/TLR4信号通路介导的心脏保护作用[29]。综上所述，外泌体主要通过TLR4/PI3K/Akt/NF-κB信号途径抑制MIR后的炎症反应。

2.4 促血管新生 血管生成在包括伤口愈合和组织修复在内的各种生理过程中起着至关重要的作用，依靠内皮细胞与其周围环境之间的紧密相互作用[10]。蛋白组学分析结果表明，间充质干细胞衍生的外泌体包含血管生成旁分泌效应子，NF-κB信号传导被确定为间充质干细胞外泌体诱导的内皮细胞血管生成的关键介质，在治疗缺血性组织相关疾病方面具有很大潜力[17]。Vandergriff等[30]使用心脏归巢肽(cardiac homing peptide，CHP)与心肌干细胞来源外泌体结合将外泌体靶向梗死心脏部位增加血管性血友病因子(vWF)的表达促进血管新生，减少瘢痕大小促进心脏修复。研究表明，在小鼠MIR损伤模型中将心脏祖细胞衍生的外泌体直接注射到小鼠心脏中可抑制心肌细胞凋亡，并进一步证实源自NADPH氧化酶的活性氧可以增强内皮细胞中的血管生成[31]，这可能是治疗缺血性心血管疾病的有效治疗策略。

2.5 修复心肌损伤 间充质干细胞通过旁分泌机制分泌外泌体减小MIR损伤的离体小鼠Langendorff心脏模型的梗死面积发挥对心脏的修复作用[32]。De Couto等[33]研究发现，心肌球来源细胞(cardiomy-ocyte derived cells，CDC)外泌体miR-181b转移到MØ中降低PKCδ转录水平并改变MØ的极化状态，缩小大鼠和猪MI/R模型的梗死面积从而保护心脏。急性心肌梗死和恢复期心肌梗死猪模型中CDC外泌体经心肌原位注射作用于猪MIR损伤模型能减少瘢痕形成，改善心脏不良重塑并缩小梗死面积[34]。Agarwal等[26]评估新生儿心脏祖细胞外泌体促进MIR损伤后的血管生成，减少纤维化和心肌肥大，修复心肌组织从而改善心脏功能；此外，研究表明，全身性使用CXCR4过表达的心脏祖细胞外泌体可缩小MIR大鼠梗死面积并提高左室射血分数，从而修复心肌损伤。

3 临床研究

Zhang等[35]对外泌体治疗MIR损伤的临床效果进行荟萃分析，根据危险区域占左心室的百分比、梗死面积占危险区域的百分数、梗死面积占左心室的百分比、左心室射血分数、左心室缩短分数、舒张末期容积和收缩末期容积评估外泌体对心脏功能的影响，其分析表明，目前可获得的数据证实了间充质干细胞分泌的外泌体在改善心脏功能方面的治疗潜力，但对于MIR损伤后这种心脏再生方法的优化和验证，还需要进一步的机制研究、治疗安全性的评估和临床试验的开展。

4 总结与展望

在心肌MIR损伤中外泌体通过抗氧化应激、减少心肌细胞凋亡、抑制炎症反应、促进血管新生、修复心肌损伤等作用来改善心脏功能。因此，外泌体对MIR损伤表现出可观的治疗潜力。外泌体作为药物递送载体在细胞间递送蛋白质和核酸等生物活性物质，实现了跨越不同生物屏障将药物有效递送至靶细胞的有效治疗策略，但是在将外泌体成功转化为临床实践之前需要克服许多不可避免的障碍，深入研究外泌体作为药物载体的可靠疗效，针对包括MIR在内的多种疾病的作用靶点以及优化的分离方法为新兴的“无细胞”替代疗法提供有益探索。