人EPCs来源外泌体修复糖尿病大鼠皮肤缺损机制研究

张雁 徐宁

[摘要]目的：探究人EPCs来源外泌体修复糖尿病大鼠皮肤缺损机制。方法：用随机数字表法将制备成功的糖尿病SD大鼠创面感染动物分为外泌体注射组（10只）和阴性对照组（10只）注射等剂量生理盐水，纱布覆盖，比较两组创面组织VEGF及bFGF水平、创面MVD、创面愈合率等指标。结果：实验组创面组织VEGF、bFGF水平、CD34阳性细胞表达、创面愈合率均显著高于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论：人EPCs来源外泌体可以使糖尿病小鼠皮肤创面血管化加快，创面愈合更加迅速，创面中VEGF、bFGF的表达很可能促进了小鼠的恢复。

[关键词]人EPCs来源外泌体;糖尿病大鼠;皮肤缺损机制

[中图分类号]R751

[文献标识码]A

[文章编号]2096-5249（2021）24-0001-02

创面愈合的过程并不简单，要使创面愈合效果较好需要细胞增殖移动、细胞外基质分泌沉淀、重生新的血管及组织重新组合等密切配合[1]。在最开始对糖尿病创面研究时，借鉴正常创面的治疗方案，后来发现糖尿病导致的创面用正常创面治疗的方法在治疗效果上大相径庭，因此找到针对糖尿病造成的创面的治疗方法称为中外医学工作者迫切解决的难题[2]。老年人的比重越来越大，在中国乃至全世界糖尿病人都显著增多，对患者生活质量的享受带来了严重的影响，疾病的难治性使患者在治疗中有大量的支出，同时社会医疗资源也承受着越来愈多的压力。如何提高糖尿病造成的创面治疗效果一直是困扰医学工作者的难题，因此越来越多的人参与到该病的研究中[3]。普通创面由于没有高血糖及身体功能代谢紊乱的影响，因此相较糖尿病创伤较为好痊愈。局部循环失常、创面部位神经坏死病变、细菌感染、细胞活力消失等都是造成创面难愈合的原因[4]。血液中血清是其组成的重要成分之一，血清中外泌体非常多，因此本文对血清外泌体促进组织再生的机制进行了研究，从而证实其促进慢性创面愈合与修复的作用，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料用随机数字表法将制备成功的糖尿病SD大鼠创面感染动物20只。5周龄，体质量在十五到二十克之间，平均质量为（17.32）g。

1.2方法（1）血清外泌体的提取及鉴定。1对小鼠进行采血，采血后静止放置六十分钟，静置完成后进行离心，离心量为两千克，0.25小时后将血清分离。离心两千克，半小时后将细胞碎片去除，将去除后的液体以1毫升为单位分成若干份分别放在其他离心管中。对离心血清提取外泌体，方法参照赛默飞公司外泌体提取说明书。观察外泌体的各方面状态（利用电子透射显微镜）。2Western blot检测外泌体的特异性蛋白CD63和HSP70的表达。用BCA法测提取的外泌体的浓度，根据检测结果计算蛋白上样量，SDS-PAGE电泳后转膜，用TBS/T洗3次，在室温状态下用脱脂奶粉封闭120分钟，TBS/T洗三次后加入一抗（CD63，1：1000;HSP70，1：1000），将冰箱温度调整到四摄氏度，将样品放置一晚。将一抗回收后，TBS/T洗3次，将相应二抗加入，在室温条件下孵育60分钟。TBS/T洗三次，显影、定影。（2）糖尿病SD大鼠动物模型的制备。选择成年、无任何疾病、SPF级SD大鼠20只，雄性和雌性各占一半。将链脲佐菌素（STZ）通过大鼠尾巴进行静脉注射，注射量为每千克七十毫克，对注射小鼠测量尾静脉血糖，观测频率为每两天观测一次，一周内观测两次。如果血糖浓度超过22.2mmol/L则糖尿病模型制备成功，将其放入专门地方进行喂养。（3）糖尿病SD大鼠动物感染创面模型的建立。实验前24小时将大鼠十五平方厘米的背毛用百分之八的硫化钠去除。称取大鼠的体重，根据体重配置合适剂量的麻醉剂，用百分之零点五的碘伏消毒后注射。将皮肤全层隔开割开，将两到三平方厘米的皮肤全层取出，制造创面。将标准金黄色葡萄球菌涂抹到创面，间断缝合，一天后再次用相同药物处理创面，感染创面大鼠模型制备成功。

1.3观察指标与评价方法（1）创面组织VEGF、bFGF：取上清双抗体夹心酶联免疫吸附法检测其中VEGF、bFGF水平。（2）创面MVD：对创面进行血管化监测。（3）创面愈合评估：对创面伤口愈合检测。（4）创面愈合观察：创面愈合率（%）=（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积。

1.4统计学方法研究中数据用SPSS22.0统计分析，计量资料（x±s）表示，用t进行检验分析。P<0.05则差异有统计学意义。

2结果

2.1两组创面组织VEGF、bFGF比较实验组创面组织VEGF、bFGF水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2两组创面MVD比较实验组CD34阳性细胞表达明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.3两组创面愈合评估分别在3、7、14和21天时用外泌体治疗的伤口的大体视图

2.4两组创面愈合率比较实驗组创面愈合率显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

3讨论

如今危害人类健康的慢性疾病种类不断发展，随着生活的变化糖尿病对人们的影响程度仅次于肿瘤和心血管疾病，美国有约2000万的人口因糖尿病而生活痛苦，在糖尿病患者中有大约四分之一的患者创面很难治愈[5]。患者因体内一些功能发生变化会导致神经功能异常、血液粘稠导致阻塞动脉以及骨关节发生病变，创面产生的很大一部分原因是因为以上并发症导致的[6]。

外泌体是直径在二十到一百四十纳米的微小囊泡，它是一种多泡体，形成方式为细胞内膜出芽方式，它能够将信息在各细胞间进行传递，很多的生理病理过程都与它有关。组织修复中外泌体的作用也极其重要，血小板MVB外模内陷形成外泌体，血小板质膜融合MVB后，将其由胞吐的方式释放[7]。随着对外泌体的不断钻研，培养的细胞类型都是可分泌外泌体，在体液中就有外泌体自然存在，如脑脊液、血液中等。随着对外泌体的深入了解，组织修复中运用外泌体发挥了不可替代的作用。EPCs具有游走特性，可促进未成熟的内皮细胞不断增殖、分化，表面标志物的表达与造血干细胞相同，可分泌有利于血管生成的的生长因子。EPCs因可促进血管生成以及可修复局部缺血组织，因此被越来越多的应用于促进创面愈合中。

通过分析实验组在创面组织VEGF及bFGF水平、创面MVD、创面愈合率等指标上均优于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。

综上所述，人EPCs来源外泌体修复糖尿病大鼠皮肤缺损中的应用效果显著，值得推广。

参考文献

[1]徐兵，李海乐，刘丹平，等.骨髓源内皮祖细胞分泌的外泌体对大鼠创伤性皮肤缺损修复的促进作用[J].吉林大学学报：医学版，2017，43（4）：180-181.

[2]李罗成，王志维，吴红兵，等.内皮祖细胞来源的外泌体减轻血管内皮细胞缺氧性损伤[J].微循环学杂志，2019，25（4）：177-178.

[3]熊武，孙安梦，皇毅，等.内皮祖细胞外泌体中与血管生成相关的miRNAs生物信息学分析[J].中国医师杂志，2019，21（04）：27-30.

[4]何强，张培华.间充质干细胞来源外泌体在创面修复中的作用及其机制研究进展[J].中国美容医学，2018，27（09）：147-152.

[5]袁叶青，包玉倩.外泌体参与糖尿病发生的机制研究[J].国际内分泌代谢杂志，2018，38（2）：102-105..

[6]林文东，李振喜，施水液，等.大鼠糖尿病动物模型建立及参芪复方干预作用机制研究[J].世界复合医学，2018，4（03）：11-13.

[7]徐江平，郭海彪，汪海涛，等.鼠神经生长因子对糖尿病大鼠皮肤损伤的促愈合作用[J].湖北理工学院学报，2015，31（03）：51-56.

基金项目：江苏大学临床发展基金（JLY20180126）

通信作者：徐宁，E-mail：xuning83@163.com