莪术提取物介导Wnt/β-catenin信号通路对人肝癌Hep-G2细胞的影响*

叶兴涛 史国军 陆 宁 董 晶 施 航 徐央波

（宁波市中医院肿瘤科，宁波 315010）

全球每年因肝癌死亡的患者超过100万人，全球病患总数中国人占43.7%，病死率近50%，治疗后5年生存率约50%，多数患者出现复发和转移[1-2]。近些年来，作为重要的细胞间黏附分子和Wnt信号转导通路的关键递质，β-catenin在肝癌方面的研究尤为重要[3]。大量数据表明，肝癌β-catenin的异常改变与Wnt信号激活有关系，β-catenin在肿瘤细胞增殖和转移过程中扮演重要角色[4-5]。莪术是姜科姜黄属植物的根茎，中医认为其功能多样，如消积、破淤、行气及止痛等，同时具有抗癌、抗早孕、抗凝血、抗氧化和保肝等作用[6]。研究显示，从莪术中提取的β-榄香烯在抗肿瘤方面作用显著，不良反应较少，对患者生存质量有明显改善作用[7-8]，但其具体作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨莪术提取物介导Wnt/β-catenin信号通路对肝癌细胞的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

TRIzol 试剂（浙江AMEKO 公司）；逆转录试剂盒（武汉赛维尔公司）；RT-PCR 试剂盒（上海优予公司）；β-榄香烯（广东中山成诺生物公司）；RPMI-1640 培养基（上海博升公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上海抚生实业公司）；Hep-G2 人肝癌细胞（上海奥陆生物公司）。

1.2 细胞培养及分组

取Hep-G2 细胞常规接种培养，待Hep-G2 细胞密度生长为60%～80%时，在培养液中加入β-榄香烯，按照所加入浓度将Hep-G2 细胞分为20、50、100 μg/mL 组，将各组Hep-G2 细胞 置 于16 孔板中培养，以不加入β-榄香烯培养液作为正常对照组，4 组培养48 h 后，弃去上层清液，更换培养基， 培养48 h，收集细胞。

1.3 RT-PCR检测各组Hep-G2 Wnt1、β-catenin mRNA水平变化

采用TRIzol 法来提取Hep-G2细胞总RNA，再反转录成 cDNA，按说明书操作，用DNA 荧光染 料SYBR Green Ⅰ对Wnt1、β-catenin 表 达 水 平进行检测，各引物序列见表1，内参采用β-actin，60 ℃、10 min，95 ℃、72 ℃， 各 30 s，95 ℃、 5 min，循环次数以40为准，实验次数至少3次，用相对定量2-ΔΔCT计算Wnt1、β-catenin mRNA水平。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.4 免疫印迹检测各组Hep-G2 细胞Wnt1、β-catenin蛋白表达

将Hep-G2 细胞进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后6 孔板中加入 100 μg 的胰蛋白酶提取液，再注入2 mL 培养基，保存在-20℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液按照4∶1 的比例混匀，将50 μg 蛋白样品电泳后转移到PVDF 膜上，加脱脂奶粉封闭1 h，加入2 抗室温封闭1 h，取出PVDF 膜TTBS 漂洗3 次，每次10 min，DAB 显色后数码相机照相，计算Wnt1、β-catenin 蛋白浓度。

1.5 流式细胞仪检测各组Hep-G2 细胞凋亡情况

收取各组Hep-G2 细胞，离心5 min，运用100 μL 结合缓冲液对细胞进行重悬，用 5 μL 标记lFITC 的Annexin Ⅴ与5 μL PI 染色混匀，无光条件下孵育15 min 后注入400 μL 结合缓冲液混匀，记录细胞凋亡情况。

1.6 划痕实验检测Hep-G2 细胞迁移能力

各取4 组1×105/mL 细胞进行饥饿处理，12 h 后再加入DMSO，24 h 后离心重悬细胞为5× 105/mL，将200 mL 细胞悬液注入Transwell 小室，加入培养基中培养12 h，培养结束拭去未迁移细胞，甲醛溶液固定8 min，结晶紫溶液染色，半定量计数，显微镜（×100）观察5 个视野。

1.7 MTT 检测Hep-G2 细胞增殖能力

取各组Hep-G2细胞接种在96 孔板， 每孔200 μL，室温37 ℃、5%CO2，培养时长不＜ 24 h，每孔加入10 μL MTT 溶液，继续培养4 h，与150 μL DMSO 溶液混匀，在酶标仪490 nm 处测量各孔的吸光值，分析细胞活力变化情况。

1.8 统计学处理

采用 SPSS 19.0 软件进行统计学处理，计量资料用±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Hep-G2 细胞Wnt1、β-catenin mRNA 及蛋白水平变化

RT-PCR 检测结果显示，正常对照组Wnt1、β-catenin mRNA 水平高于其他3 组，差异有统计学 意 义（P＜0.05）， 100 μg/mL 组Wnt1、β-catenin mRNA 水平显著低于20 μg/mL 组、50 μg/mL 组，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

图1 各组Hep-G2 细胞Wnt1 和β-catenin mRNA 水平变化Fig 1 Changes in wnt1 and β-catenin mRNA levels in Hep-G2 cells

免疫印迹检测结果显示，正常对照组Wnt1、β-catenin 蛋白相对表达高于其他3 组，差异有统计学 意 义（P＜0.05）， 100 μg/mL 组Wnt1、β-catenin蛋白相对表达显著低于20 μg/mL 组、50 μg/mL 组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）（图2）。

图2 各组Hep-G2 细胞Wnt1、β-catenin 蛋白含量Fig 2 Wnt1 and β-catenin protein content in Hep-G2 cells of each group

2.2 各组Hep-G2 细胞凋亡率比较

流式细胞仪检测结果显示，正常对照组Hep-G2 细胞凋亡率显著低于其他3 组，差异有统计学意义（P＜0.05）， 100 μg/mL 组Hep-G2 细胞凋亡率显著高于20 μg/mL 组、50 μg/mL 组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

2.3 各组Hep-G2 细胞迁移能力比较

Transwell检测结果显示，100 μg/mL组Hep-G2细胞迁移细胞数为（45.69±5.44）个，显著低于正常对照组的（125.55±12.39）个、20 μg/mL组的（109.49±12.24）个和100 μg/mL组的（87.45±9.34）个，差异有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

2.4 各组Hep-G2 细胞增殖能力比较

MTT 检测结果显示，正常对照组Hep-G2 细胞增殖能力显著高于其他3 组，差异有统计学意义（P＜0.05）， 100 μg/mL 组Hep-G2 细胞增殖能力低于20 μg/mL 组、50 μg/mL 组，组间差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

3 讨论

肝癌是众多肿瘤中致死率较高的疾病之一，死亡率占全球疾病死亡人数一半左右，严重威胁着人类生命和健康[9]。癌症的侵袭转移过程十分复杂，与各种黏附相关分子、细胞因子、调节因子、信号转导通路密切相关[10]。莪术提取物β-榄香烯具有抗转移、不易耐药、抗癌等功效，在临床多种肿瘤应用中疗效显著[11-12]。运用转基因肝癌小鼠对Wnt信号通路进行研究，结果显示Wnt 信号通路在肝癌组织中异常激活，并与下游β-catenin 产生作用，对肝癌细胞的增殖、转移有促进作用[13]。

中医治疗肝癌多以活血化瘀、消积散结为主，莪术作为常见的活血化瘀的中药，其提取物β-榄香烯是萜烯类化合物的一种，具有非细胞毒性特点，其抗癌作用机制是通过阻碍癌细胞周期来实现。其次，莪术提取物β-榄香烯提升肿瘤细胞的免疫原性，促进荷瘤对机体中免疫细胞功能的恢复，毒副作用小，同时不易产生耐药性[14-15]。有研究证实，β-榄香烯体外抑制肝癌细胞增殖能力明显，阻滞癌细胞生长周期，使其停留在G1期， 达到抑制肿瘤生长的目的[16]。本研究结果显示，100 μg/mL组Hep-G2细胞凋亡率最高，其次为20 μg/mL组、50 μg/mL组，正常对照组Hep-G2细胞凋亡率最低。正常对照组Hep-G2细胞迁移能力最高，100 μg/mL 组迁移能力最低，50 μg/mL 组迁移能力高于20 μg/mL 组。 100 μg/mL 组Hep-G2 细胞增殖能力最低，正常对照组细胞增殖能力最高，50 μg/mL 组细胞增值能力低于20 μg/mL 组。

图3 各组Hep-G2 细胞凋亡率Fig 3 Hep-G2 cell apoptosis rate in each group

图4 各组Hep-G2 细胞迁移能力，结晶紫染色，×200，标尺=50 μmFig 4 Hep-G2 cells migration ability in each group， crystal violet staining， ×200， bar=50 μm

图5 各组Hep-G2 细胞增殖能力Fig 5 Hep-G2 cell proliferation ability in each group

本研究结果还显示，正常对照组Wnt1、β-catenin 表达水平高于其他3 组，20 μg/mL 组Wnt1、β-catenin 表达水平最低，20 μg/mL 组Wnt1、β-catenin 表达水平高于50 μg/mL 组，说明β-榄香烯在一定程度上降低了Wnt1 的表达，可能通过β-catenin 信号对肝癌细胞的发生发展起重要作用。相关文献报道，调节Wnt 信号相关蛋白的活性可以产生癌基因作用，而抑制肿瘤癌基因的表达，可发挥抑癌基因的作用[17-18]。有研究表明，多数癌症患者机体中β-catenin 的表达都有提升，异常表达的Wnt/β-catenin 可加剧机体免疫细胞的损伤，如在胶质瘤中Wnt 信号表达受到抑制后，癌细胞的放射敏感性就会降低，从而提高放疗和化疗的效 果[19]。Wnt 通路在众多肿瘤中被发现，在胃癌和子宫内膜癌中的异常变化具有重要参考价值[20]。Wnt通路信号被激活时，靶器官的分化受到限制，干细胞特异性被保留，会加快肝癌细胞的分化，导致肿瘤形成[21]。

综上所述，莪术提取物在肝癌细胞的凋亡中发挥重要作用，通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路活性，抑制细胞增殖和迁移。