构建fks1基因缺陷型酿酒酵母基因工程菌改良成膜能力

王利乐，刘庆国，陈 勇,

(1.南京工业大学 国家生化工程技术中心，江苏 南京 211800；2.南京高新工大生物技术研究院有限公司，江苏 南京 211800)

能源是人类生产与生活的动力基础，燃料乙醇作为一种清洁型燃料，已成为世界各国的可再生能源研究的热点，也是工业生物技术领域寻求突破的重点产品[1-4]。其中，生物法生产燃料乙醇的传统菌株就是酿酒酵母[5]。传统的乙醇生产技术采用游离细胞发酵，但此方法存在一系列缺点，而固定化技术具有一系列优势，如可以在较高的初始糖浓度下发酵，而且细胞在产生较高浓度乙醇的发酵液中仍可保持活性，并重复利用，展示出了更高的发酵效率[6-7]。这些优点使得固定化发酵被应用于酵母发酵生产乙醇。这些优势主要得益于酿酒酵母细胞在固定化状态下可以形成生物膜，这层生物膜赋予了细胞更强的抵抗发酵环境胁迫的能力，同时减少了发酵过程中的葡萄糖抑制作用。

生物膜是微生物的一种普遍的存在方式，因为微生物在多细胞群体下的生存能力会大大提高，所以微生物会自发地倾向于形成生物膜或者菌落[8]。超过80%的微生物能够以一种膜样生长的菌落形式存在，外表面被其自身分泌的富含多糖的细胞外多聚物覆盖，这种菌群与胞外基质组成的有机体称为生物膜[9-10]。生物膜能够形成在生物体或者非生物体的表面，呈膜样生长，对抗菌因子及外界各种压力有高度抗性。因此，生物膜在工业生产和医疗方面均被广泛关注。如白色念珠菌，在生物膜状态下对抗生素的吸附能力增加4～5倍，所以对抗生素有极大的抗性，致病能力大幅提高[11]。细菌在生物膜状态下，海绵状的胞外基质具有吸附/吸收作用，可以影响细胞与外界之间营养物质、气体及其他分子的交换，一些营养物质可以保留在生物膜内，使得膜内营养物质的浓度较高，更有利于细胞对营养物质的吸收[12]。

生物膜由多种信号通路调节，如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径、蛋白质激酶A(PKA)途径，而且群体感应也可能会调节生物膜的形成。MAPK途径调节细胞类型的丝状分化及生物膜的形成过程[13]，在该途径激活状态下，转录因子Tec1可以诱导黏附素基因(如flo11)的转录，其表达量是游离细胞的2倍[14]；tec1纯合子敲除，膜形成能力严重减弱[15]。雷帕霉素作用靶标(TOR)信号途径控制着营养吸收，可以通过Tor2激活葡聚糖合成酶调节因子Rho1[16]。Rho1通过调节MAPK途径的组分Pkc1,从而控制细胞完整性[17-19]。Pkc1细胞完整性途径已经被证实参与葡聚糖合成酶fks1基因的表达[20]。而葡聚糖作为一种生物膜的组分，影响着细胞的生理特性。在酿酒酵母W303-1A的生物膜中，糖组分主要由葡萄糖、甘露糖及半乳糖组成[21]。在白色念珠菌中，β-1,3葡聚糖与药物抗性有关，对于药物敏感性起正向作用[10]。但是，不同酵母菌株间具有表型多样性，生物膜成分、调节通路也可能有所差别[22]。基因fks1编码β-1,3-葡聚糖酶催化亚基，该基因的缺失会造成葡聚糖合成酶活性减弱以及葡聚糖合成量的降低。snf1基因的缺失会影响一系列葡聚糖合成相关的高尔基体蛋白、内质网蛋白以及细胞表面蛋白基因的表达[23]，并且当snf1缺失时，fks1、fks2表达量显著降低[24]，同时侵入能力消失，成膜能力下降[25-26]，所以可以推断生物膜的形成及其强度可能与葡聚糖合成相关。笔者所在课题组研究发现，双倍体酿酒酵母1308在成膜初期fks1基因表达异常，基于这一现象，笔者欲探索fks1基因是否会影响其成膜能力。

本研究基于同源重组原理，借助CRISPR技术的便利性[27]，通过一次转化同时破坏双倍体的等位基因fks1，通过分析敲除菌酿酒酵母1308生理生化特性尝试探究fks1基因对成膜的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒

本研究所用菌株与质粒具体信息见表1。以酿酒酵母1308作为出发菌株菌，进行基因fks1的敲除。

表1 菌株及质粒Table 1 Strains and plasmid

1.1.2 试剂与培养基

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20、胰蛋白胨20、酵母粉10。制备固体培养基时，添加20 g/L的琼脂粉。用于酿酒酵母敲除后转化子筛选时，添加终质量浓度为0.1 μg/mL金担子菌素。

LB培养基(g/L)：NaCl 20、胰蛋白胨20、酵母粉10。根据培养的大肠杆菌需要，可加入50 μg/mL的卡那霉素、20 g/L的琼脂粉。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖200、胰蛋白胨4、酵母膏4、KH2PO43、(NH4)2SO43、无水MgSO41，FeSO4·7H2O 0.5、ZnSO4·7H2O 0.5。用于酿酒酵母发酵验证实验。

PLATE：40 mL PEG2000(50%)，5 mL醋酸锂(1 mol/L)，5 mL TE Buffer(10×，100 mmol/L Tris-Cl，10 mmol/L EDTA，pH=8.0)。分别配制，现配现用。

Primer STAR高保真聚合酶、酵母基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒，TaKaRa公司；DpnⅠ，NEB公司；质粒提取试剂盒，Axygen公司；single stranded from salmon testes (ssDNA) ，Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 敲除菌的构建

使用的引物由苏州金唯智公司合成，具体序列见表2。

表2 引物序列表Table 2 Primer sequence

敲除菌株的构建采用同源臂重组及CRISPR/Cas9敲除方法的联合使用：采用一定长度的同源臂，可以极大提高外源片段在菌体内的重组效率。首先在fks1基因上确定sgRNA位点，后设计引物fks1-pCAS-F2及fks1-pCAS-R2，并以质粒pCAS为模板扩增，PCR产物经DpnⅠ酶切过夜后42 ℃、90 s热激转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单菌落测序后获得sgRNA与Cas9共表达质粒pCAS-fks1。将酿酒酵母fks1基因sgRNA位点前后40 bp长的碱基序列作为敲除同源臂，连同质粒上抗性基因片段前后各20 bp分别作为前后引物，即fks1-KAN-F2、fks1-KAN-R2，序列见表2，然后这对引物以pYX212-Aur质粒为模板，扩增金担子菌素基因片段作为敲片，胶回收纯化备用。

采用醋酸锂转化法[27]，将转化试剂及酵母感受态细胞配制成转化态(表3)，30 ℃孵育30 min后在42 ℃热激15 min，然后以10 000 r/min离心1 min，将细胞用250 μL YPD液体培养基重悬，涂布于质量浓度为0.1 μg/mL金担子菌素和400 μg/mL的遗传霉素G418的双抗性YPD平板，30 ℃培养36 h，以引物对fks1-F、fks1-R3进行菌落PCR验证，即在含有体积为25 μL 0.02 mol/L NaOH的 EP 管中加入适量菌体，混匀，沸水浴 10 min后冰上放置10 min，以此作为PCR模板进行扩增。

表3 转化体系Table 3 System of transformation

1.2.2 生长性能、菌株稳定性与发酵性能分析

1)活化。将野生型酿酒酵母1308以及敲除菌△/△fks1-1308接种至装有5 mL YPD液体培养基的50 mL离心管中，200 r/min、30 ℃培养至OD600为1.0。

将活化的菌液以体积分数1%接种量接入装有100 mL YPD培养基的250 mL三角瓶中，相同条件下培养。每隔3 h取样，根据测定的菌体浓度作酿酒酵母的生长曲线。

在无抗生素的YPD固体培养基上连续传代10个批次后，将菌体影印到含有0.1 μg/mL金担子菌素抗性的 YPD 平板上，30 ℃培养1～3 d后，评估菌株生长状况。

2)发酵。将3 g固定化材料放入250 mL三角烧瓶中灭菌，然后加入100 mL灭菌的发酵培养基，以10%的接种量接入活化的种子液，摇床在30 ℃、200 r/min条件下进行固定化发酵。

1.2.3 成膜能力表型分析

1)结晶紫染色。将OD600为0.1的野生型及敲除菌△/△fks1-1308酿酒酵母以10%的接种量接入新鲜YPD液体培养基中，然后转移至96孔板上，每孔200 μL，30 ℃静置培养12 h弃液体培养基，再加入200 μL的0.1%结晶紫，静置染色 10～20 min，随后用300 μL纯水洗3遍，洗去浮色，晾干，拍照，最后加入200 μL冰醋酸，通过酶标仪在570 nm处测其OD570。

M为标准DNA；条带1～10为挑选单菌落扩增结果；条带0为原始菌扩增结果图1 DNA凝胶电泳图Fig.1 Electrophoresis of DNA

2)絮凝实验。将活化后的菌液用水稀释至OD600为1.0，取10 mL移至透明玻璃试管中静置，分别于30、60和90 min时拍照，观察其絮凝状态。

3)成膜形态SEM电镜。发酵结束后取固定化载体材料样品，用磷酸缓冲液(PBS)冲洗2遍，-80 ℃冷冻，真空冷冻干燥，然后喷金，通过TEM3000扫描电镜(SEM)观察材料表面生物膜形态。

1.2.4 胞外多糖分析

胞外多糖的制备及总组分测定。同一批发酵结束后得到的固定化载体，用纯水冲洗两遍后，加入0.1 mol/L的NaOH溶液，振荡5 min溶解胞外基质。之后5 000 r/min离心5 min，保留上清液，加入3倍体积的无水乙醇，4 ℃过夜，5 000 r/min离心5 min，保留沉淀并干燥，即为酿酒酵母生物膜的胞外多糖。用纯水将样品制备成0.5 mg/mL的溶液，分别通过苯酚硫酸法、考马斯亮蓝、二苯胺法测定其总糖、蛋白质、核酸含量[29]。

胞外多糖采用高效液相色谱分析。色谱条件：Aminex HPX-87X Column，流动相为5 mmol/L的H2SO4，流速0.6 mL/min，柱温55 ℃，示差折光检测器检测，进样量为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 敲除菌的构建与筛选

2.1.1 重组质粒的构建、敲除菌的筛选与鉴定

以fks1-pCAS-F2和 fks1-pCAS-R2为上下游引物，以质粒pCAS为模板，PCR扩增后热激法转化至E.coliDH5α化学感受态中，然后涂布于质量浓度为50 μg/mL的LB琼脂糖固体培养基平板表面，生长12～20 h，挑取单克隆于卡那霉素质量浓度为50 μg/mL、体积为5 mL的LB液体培养基中，37 ℃过夜培养后提质粒，进行DNA凝胶电泳分析，结果见图1。将阳性克隆的质粒样品送苏州金唯智公司测序，确定质粒序列，成功将20 bp靶位点替换，即成功构建pCAS-fks1质粒(图1(a))。

以实验室构建并保存的pYX212-Aur质粒为模板，以fks1-KAN-F2和fks1-KAN-R2为上下游引物，扩增带有fks1基因40 bp同源臂的金担子菌素抗性片段，约2 000 bp(图1(b))，与理论大小一致，说明成功敲除了相关的基因片断。

通过CRISPR二合一表达质粒以及敲片的联合使用，借助醋酸锂转化法将pCAS-fks1质粒与敲片同时导入野生型酿酒酵母1308中，通过Cas9蛋白在等位基因上同时造成切口，同源臂可与目的基因发生同源重组，即可实现双倍体的同时插入突变，然后涂布于抗性平板初步筛选转化子。最后通过在插入位点前后设计的引物进行转化子筛选，若双倍体插入成功，使用验证引物fks1-F、fks1-R3进行菌落PCR时，可以扩增出一条比原始菌目的片段大2 000 bp左右的单一条带。最终成功筛选出fks1基因双倍体敲除菌(图1(c))，其中条带0为以原始菌为模板的对照条带，条带3、4代表的菌株为单倍体敲除菌，条带1、2、6、7、8、10代表的菌株为双倍体敲除菌，从图1结果来看，该方法获得目的双倍体敲出菌株的概率为60%，表明该方法效率较高。保藏双倍体敲除菌株并命名为△/△fks1-1308。

2.1.2 遗传稳定性

将转化子挑选出来，在无抗生素的YPD平板上连续划线连续传代10次后，划线转移至添加0.1 μg/mL金担子菌素的YPD平板上可以正常生长，表明敲除菌性状稳定，未出现退化，为后续实验分析奠定了良好的基础。

2.2 敲除菌的生理生化性能分析

2.2.1 生长曲线

测定原始菌及敲除菌的生长曲线，结果见图2。由图2可以看出，fks1基因插入失活使其活力降低，生长速度减慢。经过连续发酵及连续平板传代之后，敲除菌菌落PCR结果显示其抗性基因依然存在并且可以在抗性平板上正常生长，证明该菌株性能稳定。但是，基因缺失使其生长速度略微下降，原始菌的最大菌体浓度出现在第30 小时左右，但是敲除菌的最大菌体浓度直到第36 小时才出现，表明该基因缺失妨碍了菌体的正常生长。之前Wang等[30]发现，当fks1单倍体基因缺失后，会伴随着生长速率减慢的现象，这与本研究的结果一致；而酿酒酵母BY4742 菌株fks1基因缺失后的生长速率正常，啤酒酵母工程菌G-03/C生长先慢后快，然后在稳定期时菌体浓度和原菌相差无几[32]。这结果表明基因fks1对不同酿酒酵母菌株的影响并不完全一致。

图2 不同菌株的生长曲线Fig.2 Growth curves of different strains

2.2.2 敲除菌结晶紫染色及絮凝实验

关于fks1基因缺失后的细胞抗逆性能力已有研究，如Wang等[30]证明在一定浓度的NaCl、乙醇、米卡芬净等压力环境中，fks1基因缺失会造成生长能力的减弱。微生物在聚苯乙烯表面吸附并形成菌落聚集体被认为是形成生物膜的表现之一，结晶紫染色后则可以直观地表现出在聚苯乙烯表面吸附菌体的数量，结晶紫染色越深，表明菌体量越多。将fks1与成膜能力联系起来，并通过结晶紫染色与絮凝实验这两个常用的试验方法表征成膜能力，结果见图3。

由图3可知：敲除菌在96孔板上的着色效果明显强于原始菌；结晶紫染色的吸光度数值越大，聚苯乙烯表面吸附菌体的数量越多，敲除菌的OD600远大于原始菌，表明敲除菌吸附在聚苯乙烯表面的菌体数量比原始菌多；另外，根据絮凝实验结果可以看出，敲除菌的絮凝速度略快于原始菌。由此可见，敲除菌在聚苯乙烯表面的成膜能力及絮凝能力均有所增强，反映了其成膜能力的增强。

2.2.3 平板冲洗及半固体培养基浮游扩散生长试验

成膜能力同样也可以通过在固体及半固体培养基上的侵入及扩散效果来表征，平板冲洗实验可以表征菌体侵入能力，是在临床医学方面研究生物膜特性最常用的分析手段之一，菌体在平板上的残留量越多，表示侵入能力越强。因此考察平板冲洗及半固体培养基浮游扩散生长试验，结果见图4。

由图4可知：在2%的琼脂糖固体培养基上培养单菌落2 d后，敲除菌的菌落较小，所以扩散能力弱于原始菌，但其侵入能力却大大增强，表现为菌落深入固体培养基并持续生长；在半固体培养基培养7～14 d，观察到敲除菌较原始菌的扩散能力稍弱，表现为菌落表面积较小，这可能与其生长速度较慢有关。但Hope等[22]通过观察多种酵母菌株生物膜相关表型，在统计学上表明双倍体的侵入能力与聚苯乙烯吸附能力只有弱相关性，说明仅仅通过表型来验证成膜能力是不充分的。因此有必要从固定化发酵实验来探究生物膜的变化。

图4 平板冲洗及半固体培养基浮游扩散生长试验Fig.4 Plate wash and semi-solid medium expansion growth test

2.2.4 固定化发酵及材料表面的成膜状态

将敲除菌和原始菌进行了一个批次的固定化发酵实验，结果见图5。由图5可知：敲除菌和原始菌的葡萄糖消耗速率分别为(5.36±0.02)、(4.46±0.01) g/(L·h)，乙醇生成速率分别为(2.39±0.01)、(2.02±0.01) g/(L·h)，表明fks1基因缺失后，耗糖速率降低，与之前生长曲线图谱的结果相吻合，生长速度慢、耗糖速率低导致了乙醇生成速率随之降低；两株菌的乙醇得率分别为0.44±0.01、0.45±0.01，两者产量基本相同，说明fks1基因对乙醇产量并未造成显著影响。同时，发酵结束后取发酵液样品测其游离菌体量，结果发现，敲除菌游离菌体远远少于原始菌，可以侧面反映出敲除菌固定化在载体上的菌体数量远多于原始菌。但是由于基因缺失后，乙醇产率的降低在工业化生产中非常不利，所以对于该基因缺失后如何弥补其带来的生长缺陷仍值得进一步探究。

图5 固定化发酵数据及固定化载体扫描电镜图Fig.5 Fermentation results and SEM images of immobilization carrier

将固定化发酵结束后的载体保留并取样，取部分材料作为样品，在TEM3000扫描电镜下观察其形态差异，可以发现，敲除菌在载体上的附着效果强于原始菌，表现为材料表面黏附的菌体数量增多且胞外分泌物变得清晰可见，成膜效果更明显。综上所述，敲除菌在固定化材料上的成膜效果强于原始菌。

2.3 胞外多糖的组分测定及高效液相色谱分析

苯酚硫酸法测定胞外多糖中总糖比例，敲除菌和原始菌分别为7.97%、4.89%；通过考马斯亮蓝测蛋白，比例分别为2.57%、3.81%，二苯胺法基本无法检测到核酸存在，证明采用的胞外多糖的制备方法比较可靠。但是作为主要成分的多糖含量明显偏低，主要成分仍未知，Al-Fattani等[33]证明胞外基质组分中含有糖醛酸等成分，故对其组分进一步探究。

通过三氟乙酸水解，将糖的多聚物分解为单糖分子，使糖组分及糖醛酸组分通过高效液相色谱可以被检测，结果见表4。由表4可知，胞外基质主要组成成分为半乳糖醛酸，同时含有葡萄糖、甘露糖，其比例分别为88∶ 9∶ 3、92∶ 4∶ 4。其中，fks1基因缺失后，葡萄糖在胞外多糖中的比例明显降低，甘露糖含量略微上升。fks1基因缺失后，对细胞壁的结构和功能造成了影响，进而影响了其通透性及有关葡聚糖及甘露聚糖相关合成基因，这是造成胞外多糖成分变化的原因。

表4 胞外多糖组分检测Table 4 Analysis of extracellular polysaccharide component

3 结论

通过构建fks1基因双倍体敲除菌，发现敲除菌侵入、黏附等成膜表征能力增强，借助SEM直观地观察到敲除菌在载体上胞外分泌物的增多，表明成膜能力提高。初步分析了胞外多糖的单糖组成成分，结果发现了半乳糖醛酸、葡萄糖和甘露糖的存在。当fks1基因缺失后，生物膜中葡萄糖组分的比例明显减小，同时，甘露糖含量增多，推测葡萄糖比例减少、甘露糖比例增多可能是生物膜增强的原因之一。因为甘露糖分子总是以甘露聚糖或者甘露糖蛋白的形式存在，所以猜测在酿酒酵母成膜这一过程中，甘露糖或者甘露聚糖有助于酿酒酵母1308成膜。此前，对于酿酒酵母fks1基因的研究主要聚集在对酵母细胞壁及自溶性能等方面，或是白色念珠菌的药物互作，本研究将fks1基因直接与生物膜相联系，并证明了有相关性，即首次揭示了fks1基因的缺失会影响酿酒酵母1308的成膜能力，但生物膜成膜机制十分复杂，仍需进一步研究探索。