脑脊液宏基因组二代测序技术及其在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用进展

张梦瑶，任建发，陈亚南，邸卫英

1河北大学附属医院，河北保定071000

中枢神经系统感染性疾病[1]包括脑膜炎(脑膜或脊膜的炎症)、脑炎，是指由细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原体引起的炎症性疾病，临床表现最常见的神经系统症状为发热、头痛，部分表现恶心、呕吐、烦躁，甚至抽搐、昏迷等症状，在神经系统疾病中，除脑卒中外，脑(膜)炎致残率排首位，致死率排第二位。中枢神经系统感染性疾病的病原学诊断主要依靠脑脊液涂片镜检、病原体培养、抗原抗体检测、PCR检测，具有早期难以诊断、治疗效果不佳、预后差等特点，针对于此，临床如何早诊断、早识别、早治疗已成为研究的重点。宏基因组二代基因测序(mNGS)技术利用鸟枪测序原理，可以检测出样本中已存在的所有脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)信息，进而分析整个微生物组及患者样本中的人类基因组和转录组，得到致病微生物的信息[2]。脑脊液mNGS技术的应用提高了中枢神经系统感染性疾病的早期诊断率。目前关于脑脊液mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病诊断的应用研究虽然不多，但也取得了一些进展，现将脑脊液mNGS技术的特点及其在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用进展综述如下。

1 mNGS技术的特点

目前中枢神经系统感染性疾病的病原体鉴定方法有体液培养检测、药敏试验、抗原抗体检测、涂片镜检和PCR。PCR是基于已知病原菌的基因组序列，虽然在敏感性、特异性和检测时间上具有一定优势，但是所能提供的信息有限。mNGS技术是一种无偏倚的检测方法，它不使用任何引物或探针进行特异扩增，可以对临床样本中的核酸直接地进行高通量测序，阳性率在25%～50%，耗时1～3 d，可检测10 000～20 000种微生物，故mNGS技术可以检测新病原体，可以作为排除广泛潜在中枢神经系统传染病的合适工具，同时对于混合感染的检测也具有重要作用；并且当临床表现不典型时会遗漏一些未考虑到的病原体，此时mNGS技术可以做出补充，降低漏诊率；mNGS技术同样适用于多种局灶性组织的检测，并在疑似局灶性感染期间提供可靠的结果。对于难确诊性感染，如不明原因发热、常规临床检测反复阴性或未知病原体的鉴定方面，脑脊液mNGS也发挥着重要作用[3]。

与常规检测方法相比，mNGS技术的阳性百分比一致性显著高于常规方法和培养，进而增加病原体的识别率。其原因如下：样品收集前的抗菌处理会影响培养阳性率，而mNGS技术不会受影响[4]；mNGS技术的机制是检测病原体片段，而培养需要活微生物，所以一些培养阴性的样本，mNGS技术可在85.00%患者中获得其余的病原学诊断。与常规培养和菌株鉴定相比，mNGS技术的时间消耗更短，因此mNGS技术可以用于辅助诊断培养率相对较低或周期较长的病原菌(如：细胞内病原菌、分枝杆菌家族)。

对于中枢神经系统感染性疾病，目前的常规检测方法常常造成漏诊、误诊，在不同的中枢神经系统感染性疾病中，不同的检测方法有各自的优势和劣势，当常规检测无法给出明确的诊断，或者常规检测的检测结果与临床表现不一致时，mNGS技术作为一项精准的检测方式，可以给出更加明确的结果，从而可以指导临床。

在不同的感染中，mNGS技术的阳性结果标准是不同的，制定标准的合理性直接影响结果的敏感性和特异性，进而影响结果的判读，甚至影响临床诊疗。而当实验中存在污染，或者感染的是一些特殊菌的时候，实验结果会出现假阴性，耽误诊疗进程，严重影响预后。对于细菌和病毒来说，阳性的标准是映射到一种微生物(物种水平)的读数比任何其他微生物的读数多10倍时；而真菌是指当一种真菌的覆盖率(种级)比另一种真菌的覆盖率大5倍时；结脑则是指至少有一个读码被映射到结核性脑膜炎细胞(MBTC)的种或属水平[5]。

CSF的mNGS技术有假阴性的情况。部分仅通过血清学检查诊断的病例通过CSF进行常规的直接检测试验是阴性的；从除脑脊液以外的其他样本中，如脑活检中诊断出的mNGS阳性的病例容易出现假阴性结果；由于脑脊液中病原体效价低而导致mNGS假阴性，如常规微生物学试验证明是阳性或结果不一致，包括牛分枝杆菌感染、结核分枝杆菌、隐球菌、痤疮丙酸杆菌、梭形芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、巨细胞病毒和2型单纯疱疹病毒；部分已检测到遗漏的细菌和真菌病原体的读图，但其丰度太低，未达到预先确定的报告阈值，未在报告中呈现出来；当高宿主背景的脑脊液样本中有潜在致命的有机体时假阴性率也较高，自身免疫性脑炎的宿主背景较低易漏诊。

2 mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病诊断中的应用

对于中枢神经系统疾病而言，mNGS技术已经成为处理新兴的传染病暴发和传染病的一流实验室方法；mNGS技术作为慢性和复发性脑炎的一线诊断试验和急性脑炎的二线试验；当处于以下情况时，脑脊液mNGS技术应被视为急性中枢神经系统感染的一线检查：①患者病情危重之时，需要及时并且精准的治疗；②临床表现不是特异性的，并且使用许多针对靶标特异性的检测来确定感染原因；③需要排除广泛的潜在病原体；mNGS技术与常规测试相结合可帮助排除怀疑自身免疫性脑炎患者的活动性感染，这些患者通常有轻度至中度淋巴细胞多细胞增生症；当mNGS与常规测试的结果相一致时，mNGS技术的意义在于不但可以保证常规检测的诊断是无误的，也可能检测或排除合并感染[6]，特别是对于免疫功能低下的患者。

2.1 mNGS技术在病毒性脑炎/脑膜炎诊断中的应用 病毒性脑炎/脑膜炎的病原体检测方法主要有脑脊液染色、抗原抗体检测和PCR技术等方法。mNGS技术在检测罕见的、新发现的或非典型的病原微生物中起着重要作用。2015年，德国利用NGS在脑中发现了松鼠博尔钠病毒进而确诊了3例基底节脑炎感染病例，这是此病毒可以向人类传染的第一个证据。2017年，复旦大学华山医院感染科张文宏教授团队，利用NGS技术在1例患有眼内炎患者的玻璃体液中发现了伪狂犬病毒(PRV)[7]，这是首例证实PRV可以感染人类，并引起眼内炎的病例。次年，由北京协和医院神经内科关鸿志教授领导的多中心脑炎合作小组利用NGS技术报道了全球首例PRV导致人类脑炎的病例[8]，此脑炎协作组关于病原宏基因组学脑炎/脑膜炎的研究纳入了来自20家医院的276例脑炎或脑膜炎患者，主要是细菌和病毒，人类疱疹病毒3型，人类疱疹病毒1型，结核分枝杆菌、单核细胞增生李斯特菌和布鲁菌，未涵盖RNA病毒，mNGS阳性率达36.6%，同时Wilson等[9]团队在《新英格兰医学杂志》发表了关于病原mNGS脑炎/脑膜炎临床应用多中心研究的文章，包括来自美国医院的204例原发性脑炎、脑膜炎和脊髓炎患者，检出结果以病毒为主，尤其检出4例肠病毒，mNGS阳性率15.7%。

2.2 mNGS技术在细菌性脑膜炎诊断中的应用 细菌性脑膜炎的传统微生物学检测方法多为外周血或脑脊液革兰染色、血清学分型、病原菌的分离培养。2013年，Lavezzo等[10]对脑膜炎奈瑟菌爆发流行时感染患者的细菌分离物进行测序，发现NGS可以作为分子流行病学的补充，能够很好地监测感染性疾病的爆发。2014年，新英格兰杂志报道了1例14岁先天性免疫缺陷的儿童，发热、头痛4个月后出现昏迷，常规检测方法未发现病原体，NGS在脑脊液发现可疑感染的钩端螺旋体序列，PCR和血清学测试均证实了结果的准确性，应用青霉素G治疗有效[11]，预测NGS将改变临床实践中检测和鉴定病原体的能力。随后mNGS技术先后检测出以嗜盐菌[12]、链球菌、不动杆菌、假单胞菌、奈瑟球菌、布氏杆菌[13]、单核增生性李斯特菌[14]等一系列细菌性病原体，mNGS技术在临床中枢神经系统细菌感染的诊断中发挥着越来越重要的作用。

2.3 mNGS技术在结核性脑膜炎诊断中的应用 结核性脑膜炎的常规脑脊液检测方法有培养、AFB染色、Xpert MTB/RIF和聚合酶链反应(PCR；又称 Sanger测序),常规检查的检出率很低，不到40%[15]，培养是诊断的金标准，但需要耗时2～4周，且效率低(0～40%)[16]，AFB染色敏感性低，但它普遍可用，价格便宜，而且快速，允许重复检测以提高敏感性。世界卫生组织已正式建议Xpert MTB/RIF用于结核病诊断[17]，评估其对结核性脑膜炎诊断的敏感性约为60%[18]。王胜南等在研究中表明，mNGS技术的敏感性最高(66.67%)，其次是AFB染色法(33.33%)、PCR法(25%)和培养法(8.33%)。反复AFB使阳性检出率提高到36.36%。mNGS技术检测结果与总AFB的一致性为22.22%，与所有常规方法的一致性为44.44%。mNGS技术与常规方法相结合，使检出率提高到95.65%。提示mNGS技术(78.26%)是检测分支杆菌DNA最灵敏方法；mNGS技术可能被用作结核性脑膜炎诊断的一线诊断工具；mNGS技术与常规方法的结合将使检测率最大化[5]。

特殊的是，基因检测表明，在大多数情况下，映射到分枝杆菌核苷酸的读数较少。分枝杆菌的检测更为复杂，因为分枝杆菌是细胞内的病原体，在脑脊液中的丰度非常低。同时由于结核杆菌数量少，污染可能性低，建议结核杆菌检测的截止值应该设定得较低。

2.4 mNGS技术在隐球菌性脑膜炎诊断中的应用 对于隐球菌性脑膜炎，目前临床上常用检测方法有脑脊液墨汁染色、培养及荚膜抗原测定。真菌培养耗时 2～4周，脑脊液阳性率为 62%，隐球菌难通过血脑屏障，血液阳性率仅8.6%～16%[19]。脑脊液墨汁染色敏感性高达90%[20]。隐球菌荚膜抗原测定敏感性及特异性为93%～100%[21]，但当其超过100 μg /L时无法继续滴度测定，且无法确定为哪种类型隐球菌感染。王芳等[22]发现，脑脊液隐球菌荚膜抗原检测阳性率最高，其次是mNGS技术，墨汁染色次之，培养最差。

葛瑛等[23]指出，流行病学数据表明，我国隐球菌性脑膜炎主要按新型隐球菌治疗，实际上新型隐球菌感染和格特隐球菌感染在疾病进展和治疗方案上存在明显差异，HIV阴性患者中出现格特隐球菌者神经系统并发症的比例更高，如脑组织多发性肉芽肿性损伤，其对抗真菌药物的反应差，必要时需进行神经外科手术干预。目前，通过以上几种常用检测方式均无法对二者进行鉴别，mNGS技术则可有效区分二者。

3 mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病诊断中面临的挑战及解决方案

尽管mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病发挥着越来越重要的作用，但是其在应用过程中仍然面临着很多挑战。①生物信息学挑战：目前用于分析mNGS数据的用户友好型生物信息软件[24]尚不够完善，建议更新公共数据库，使用云平台实现信息共享，以便临床医生加强沟通，推动mNGS技术的临床应用，加速mNGS技术的发展。②成本过高：尽管序列数据的生成已大大降低了成本，但是用于测序的样品试剂的总体成本仍然很高，由于mNGS技术采集脑脊液的时间可能与脑脊液中病原体出现的高峰时间不同，因此重复检测mNGS技术可提高敏感性，但是成本过高会限制它的广泛使用和重复检测，并且大多数实验室缺乏机器人设备、自动化协议，过多的人工投入会增加成本。还有确保监管而采取的生物信息学分析渠道会显著增加成本，可以通过改进硬件方面的技术，以提高通量降低成本，使用液体处理生物机器人来提高自动化程度，开发用于NGS样品库制备的微流控设备来降低成本。③监管复杂：mNGS技术的实验正常完成需要全程进行质量控制，包括初始样品质量检查，库参数(浓度和大小分布)，序列数据生成(簇密度和Q评分)，内部控制的恢复和外部控制的执行，每一步骤都需要确保无误[2]，才能顺利完成测序。④目前的试验结果可能有误差：实验表明，目前多为单中心回顾性横断面研究，入选的患者可能在临床分析过程中引入一些偏差;然而前瞻性临床研究了解何时进行mNGS，对成本控制更有益处，应鼓励临床大夫多进行前瞻性多中心研究。⑤样本量的多少、样本的污染和脑脊液的选取影响阳性率的结果：目前部分实验提供的样本量较少，最终可能会影响阳性率等计算。对于样本采集和(或)处理过程中的样本污染，包括与背景污染相关的微生物，虽然实验结果达到了预设的mNGS阳性结果标准，但与患者的临床特征不符，这使得检测的假阳性率增高。为了减少污染的潜在影响，我们为mNGS阳性结果定义了严格的标准，同时临床医生应该谨慎解释当mNGS阳性检测结果为医院常见的细胞外细菌或真菌，特别是当在一次NGS检测中检测到多种细菌时，除此之外，病毒和寄生虫的阳性mNGS技术检测不太可能是假阳性；病毒和寄生虫的阳性mNGS测试假阳性的可能性不大。其次我们还应该严格控制工艺，采用单向作业、前置放大区域的正压通风和分隔不同测定步骤的工作空间；并且我们还可以通过标准化新试剂的质量控制测试、定期擦拭仪器和实验室表面、连续追踪看到的污染物来监控污染[24]。部分研究检测结果的阳性百分比一致性较低[9]，一部分原因是选取的有效脑脊液是暴露于经验性抗生素或经历多次冻融循环之后，还有就是因为部分患者是转诊，进行mNGS之前已经经过治疗，导致入组患者存在偏倚。囿于部分检测工具的限制，部分样本测序深度不够，造成实验的敏感性较低，可以通过增加样本测序深度，改善此问题。⑥当前的数据库可能会造成漏诊，影响实验结果：mNGS技术能够识别新病原体，但囿于参考数据库的限制，并非所有病原体都可以被识别，造成漏诊；并非患者均进行RNA测序，可能遗漏罕见的感染病毒，如RNA病毒[4]，并且RNA非常容易降解，因此需要较高的检测条件，在解读RNA病原体报告时，有必要考虑样品运输和实验室条件；因为需要检测的信息量较大，不可能列出报告中发现的所有病原体，对于罕见病原体、胞内菌等，由于其序列较少且丰度较低，在报告中未列出，基于此，如果存在可疑的特定病原体的临床感染，则可以追溯原始数据库以进行查询。⑦当检测结果提示EB病毒(EBV)阳性时，还可能合并其他感染原因，容易造成误诊。尤其需要注意的是，当检测到某种病原体的DNA为阳性，但与患者的临床表现和特征并不相符时，要高度警惕是否存在EBV感染。在当前的研究中，一些患者的EBV呈阳性，但有其他更可能的感染原因，因为EBV DNA经常与其他微生物一起被检测出来。

综上所述，脑脊液mNGS技术作为一项精准的检测方式，对于检测新病原体、提高检测阳性率、降低漏诊率和诊断难确诊性感染起着重要作用，在病毒性脑炎/脑膜炎、细菌性脑膜炎、结核性脑膜炎和隐球菌性脑膜炎的诊断中起着不可替代的作用。但脑脊液mNGS技术在临床应用中，同样也面临着一些挑战，包括生物信息学挑战、成本过高、监管困难、试验误差、样本问题以及漏诊、误诊等。尽管mNGS技术从实验室应用到临床的时间并不久，但mNGS技术在中枢神经系统感染性疾病中具有光明的前景，期待未来十年可获得更多评估mNGS技术的临床效用和成本效益的前瞻性临床试验数据[25]。