脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶的构建及侵入性观察

陈智毅，潘道延，杨嘉旖，林凯桑，胡世弟，张彤，周凌燕，沈洁

南方医科大学第三附属医院，广州510000

糖尿病慢性难愈性溃疡是指糖尿病患者由于机体长期慢性高血糖导致皮肤软组织血运障碍、神经病变，在皮肤受损情况下造成3个月以上迁延不愈的创面[1]。针对糖尿病慢性难愈性溃疡的治疗，目前国内外缺乏针对性强、效果好的手段[2]。间充质干细胞因其具有改建血管、增强下肢血流、修复糖尿病周围神经病变、调节免疫等作用在组织修复领域受到广泛关注[3]。但间充质干细胞移植固有的全身性风险、效率低下、伦理问题亟待解决[4]。研究[5]显示，外泌体是由多种类型的细胞分泌的多泡内涵体与细胞膜融合后释放到细胞外的一种大小在60～150 nm之间的膜性小囊泡，里面含有蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs、信号分子等多种不同的活性物质。外泌体可通过与细胞膜的融合，将其中的递质转移到另一细胞，从而实现跨细胞信息传递并调节细胞间信号传导，发挥多种生物学功能。目前多项研究[6～8]表明，基于间充质干细胞来源的外泌体的非细胞治疗较细胞移植治疗更为安全、便捷，但外泌体治疗还存在靶向性不足、作用时间有限等问题。结合本课题组前期研究，我们认为以水凝胶负载外泌体进行治疗是一种可行的思路。本研究构建了脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶，并观察其温敏性和侵入性，为糖尿病慢性难愈性溃疡的治疗提供了新思路。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂 脐带间充质干细胞株Saliai-HMSC(UC)-N由广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司提供，细胞株已经完成鉴定，经过细菌、真菌、支原体和病毒检测显示，该细胞可表达多种干细胞特异性标记物，具有良好的增殖分化潜能。人脐静脉内皮细胞株C-12206购自德国PromoCell公司。外泌体提取试剂盒购自美国SBI公司，Pluronic F-127粉末购自美国Sigma公司。

1.2 脐带间充质干细胞来源的外泌体的提取 取Saliai-HMSC(UC)-N细胞在培养皿中进行传代培养，生长至95%融合时，无菌PSB缓冲液冲洗2次，加入去外泌体完全培养基继续培养96 h后，收集细胞培养上清，加入新的去外泌体完全培养基继续培养，每一皿细胞按相同方式收集3次细胞培养上清。将收集的细胞培养上清经过40 μm细胞滤网过滤后，分装于15 mL离心管中，每管分装量为10 mL，以3 000×g离心15 min，取上清液，按1∶5比例加入外泌体提取试剂，上下倒置3次混匀，4 ℃冰箱中静置18 h后，以1 500×g离心30 min，弃上清，再以1 500×g离心5 min，移液枪吸净沉淀之上的液体，视沉淀量加入100～500 μL PBS进行重悬，即得脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液。

1.3 外泌体-温敏水凝胶的构建 称取适量提前预冷的Pluronic F-127粉末，避光条件下按20%、22%、24%、26%、28%的浓度梯度分别加入1 mL浓度为300 μg/μL的脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液，移液枪在冰浴条件下吹打至混悬状态，4 ℃冰箱静置1 h，待沉淀完全溶解后，即得到20%、22%、24%、26%、28%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液。

1.4 不同浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的温敏性测定 ①初始凝胶化温度测定。开启恒温水浴锅，加入冰块调节水浴锅温度至10 ℃，以10～40 ℃为测量范围、每次测定温度间隔0.2 ℃，测定不同浓度(20%、22%、24%、26%、28%)外泌体-温敏水凝胶溶液的初始凝胶化温度。②37 ℃初始凝胶时间测定。开启恒温水浴锅，调节温度至37 ℃，测定不同浓度(20%、22%、24%、26%、28%)外泌体-温敏水凝胶溶液的37 ℃初始凝胶时间。

1.5 24%浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的侵入性测定 ①首先对外泌体使用PKH67进行标记：避光条件下，将250 μL PKH67染色试剂盒C液分别与2 μL PKH67染料以及脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液混合，随后将混合后的两种液体再次混匀，室温下静置5 min后加入500 μL 1% BSA终止反应；加入200 μL外泌体提取试剂，混匀后于4 ℃冰箱中静置2 h后以12 000×g离心10 min，保留沉淀，使用PBS清洗去除残余染液，以2 mL PBS重选，即得到PKH67标记的脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液。参照“1.3”方法，制作PKH67标记的24%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液。②将脐静脉内皮细胞接种到12孔板上，加入等量完全培养基培养至85%融合，分成2组，即外泌体组、外泌体-温敏水凝胶组。外泌体组加入1 mL PKH67标记的脐带间充质干细胞来源的外泌体重悬液，外泌体-温敏水凝胶组加入1 mL PKH67标记的24%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液。两组细胞于5% CO2细胞培养箱中避光孵育12 h，避光条件下冰浴吸净液体，以PBS清洗三遍后滴加稀释的DAPI细胞核染色液，避光孵育30 min，置于荧光倒置显微镜下观察。荧光倒置显微镜下外泌体呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光。③取外泌体组、外泌体-温敏水凝胶组细胞，随机选择4个不同的视野进行拍照，使用Image J软件计算绿色荧光光密度百分比、绿色荧光面积百分比。绿色荧光光密度百分比=绿色荧光光密度值/蓝绿色荧光总光密度值×100%，绿色荧光面积百分比=绿色荧光面积/蓝绿色荧光总面积×100%。

2 结果

2.1 不同浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的温敏性测定结果比较 ①20%、22%、24%、26%、28%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液的初始凝胶化温度分别为(17.8±0.7)、(16.6±0.3)、(14.6±0.5)、(13.4±0.3)、(12.4±0.1)℃，各浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的初始凝胶化温度相比，P均<0.05。②20%、22%、24%、26%、28%浓度的外泌体-温敏水凝胶溶液的37 ℃初始凝胶时间分别为(92±6)、(79±5)、(68±3)、(51±3)、(46±2)s，各浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的37 ℃初始凝胶时间相比，P均<0.05。温敏性测定结果说明，本研究成功构建了脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶，具有良好的温敏性。通过对不同浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的初始凝胶化温度、37 ℃初始凝胶时间比较可知，若将外泌体-温敏水凝胶应用于动物或者人体时，24%浓度的外泌体-温敏水凝胶具有相对可控的凝胶时间与初始凝胶温度。

2.2 24%浓度外泌体-温敏水凝胶溶液的侵入性测定结果比较 ①荧光倒置显微镜下可见，外泌体组、外泌体-温敏水凝胶组绿色荧光点分布在细胞质内，并于细胞核周围富集。②外泌体组绿色荧光光密度百分比、绿色荧光面积百分比分别为0.02%±0.01%、0.11%±0.01%，外泌体-温敏水凝胶组绿色荧光光密度百分比、绿色荧光面积百分比分别为0.21%±0.05%、1.30%±0.12%，两组相比，P均<0.05。

3 讨论

糖尿病慢性难愈性溃疡是一种严重的糖尿病慢性并发症，最常见的临床表现为糖尿病足溃疡及糖尿病性压疮，目前糖尿病慢性难愈性溃疡缺乏有效的治疗手段，预后极差。研究[9]发现，在糖尿病患者的一生中出现糖尿病足的可能性高达15%，而因糖尿病足住院的患者在所有糖尿病住院患者中占47%。糖尿病慢性难愈性溃疡形成后很难完全愈合，20%的患者最终面临截肢，有截肢适应证的糖尿病患者5年死亡率也高达39%～80%，治疗难度极大。Redd等[10]认为，糖尿病足难以愈合的一个主要因素是创口的血管生成受阻。在基础研究[11]中发现，血管的节段性病变以及毛细血管网的衰减将导致血流变差，从而影响创面的愈合。从这个角度而言，针对糖尿病慢性难愈性溃疡创面，恢复血流供应以及毛细血管网的功能是治疗的核心。

间充质干细胞为目前糖尿病慢性难愈性溃疡治疗手段稀缺的局面开创了新的思路。已经有相当多的基础以及临床研究[12]证明，在糖尿病慢性难愈性溃疡治疗领域，间充质干细胞具有极其优秀的效果及独特的优势。外泌体的主要作用是实现细胞间的沟通并进行调控。目前已有多项研究[6]表明，间充质干细胞来源的外泌体在组织修复中具有优秀的效果，甚至认为间充质干细胞来源的外泌体在组织修复的效果等同于乃至强于间充质干细胞移植。但目前很少有研究将外泌体用于治疗，这是由外泌体的特性所决定的。一方面，几乎所有的细胞都会对外泌体进行摄取，静脉输注难以到达目的细胞，靶向性极差；另一方面，室温情况下外泌体会迅速膨胀、失效，局部输注或者外敷效果很差。由此，结合我们团队的前期研究[13]，本研究应用了Pluronic F-127作为载体构建了外用的新型脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶并对其物理特性及效果进行了初步评估。本研究首先培养了脐带间充质干细胞，按照特定流程收集培养上清，随后使用沉淀试剂盒对外泌体进行提取，获得白色沉淀，对沉淀进行重悬后，获得外泌体重悬液。温敏特性测定的结果表明，随着外泌体-温敏水凝胶浓度的增加，初始凝胶化温度以及37 ℃初始凝胶时间均会随之降低，表明新构建的复合水凝胶具有温敏特性，这表明在低温下外泌体-温敏水凝胶保持液体状态，在应用到人体后可以迅速凝固成半固态，应用到糖尿病慢性难愈性溃疡这种可能合并窦道的不规则伤口中，可以提供支持以及完全填充难以发现的深部伤口。

外泌体-温敏水凝胶溶液的侵入试验中，可见外泌体组以及外泌体-温敏水凝胶组均出现绿色荧光，高倍镜下可见绿色荧光出现在细胞核周围，半定量分析结果表明，经细胞核面积校正的外泌体-温敏水凝胶组的绿色荧光面积百分比与光密度百分比均高于外泌体组，表明外泌体-温敏水凝胶比单纯的外泌体具有更好的外泌体侵入效果。考虑到外泌体在室温下迅速失去治疗效果的特点，我们认为温敏性水凝胶主要通过延长外泌体的作用时间、延缓外泌体的失活从而达到更好的侵入效能。

综上所述，本研究成功构建了脐带间充质干细胞来源的外泌体-温敏水凝胶，具有良好的温敏特性和侵入特性。干细胞移植尚存在一系列的缺陷，其本身就具有一定的风险，免疫排斥、诱导畸形、诱导癌症以及肺栓塞的风险一直存在[14]。而外泌体直接用于治疗则存在作用时间严重不足、靶向性不够等问题。采用温敏水凝胶作为支架对脐带间充质干细胞来源的外泌体进行移植，目标是打破常规干细胞移植以及传统外泌体治疗的局限性，为干细胞的临床使用提供新的思路，提高干细胞应用的有效性和安全性，也为外泌体的临床应用打开一条新的出路，这表明了脐带间充质干细胞来源的外泌体-温 敏水凝胶具有良好的临床应用前景，但这仍需更进一步的动物实验乃至临床试验来进一步验证。