纤维环修复的动物实验与临床研究的现状

李贵谦，韦华璞，张世进，陈前芬，施冬冬*

(1解放军第923医院骨科，广西 南宁；2广西医科大学第二附属医院，广西 南宁)

0 引言

纤维环(Annulus fibrosus，AF)是包绕在椎间盘外围的结构，主要由胶原蛋白组成(I型和II型胶原纤维占干重的60%)[1]，它就像一个密闭的容器，通过产生静水压力抵抗脊柱轴向负荷，保护着里面的髓核[2]。当椎间盘承受的压力过载后，破坏了纤维环的完整性，髓核通过破裂口疝出，当其后方的神经根受到压迫时，引起LDH[3]。临床常用的治疗是单纯髓核摘除术来缓解疼痛，早在2003年，我国每年开展该手术就达到120人次/百万[4]，但即使在孔镜这样的微创操作下术后再突出率也高达10%[5]，国外的文献报道复发率甚至超过了15%[6]。目前多数研究已明确认定有效的纤维环修复可以显著改善LDH的手术结果，不仅可提供物理屏障降低再疝率，改善生物力学，还有可能成为椎间盘再生研究策略的一部分，因此越来越受到人们重视。本文将简要探讨纤维环修复与基础和临床的关联并分享相关进展。

1 动物实验研究

现有的文献报告中动物模型可以很好的进行体内纤维环修复，其中主要包括了研究天然生物材料支架、基于干细胞的修复、胶原蛋白凝胶填充等技术。随着组织工程技术的兴起，为了更好的完成组织再生修复功能，组织工程支架应在结构和功能上更好的模拟细胞外基质。而胶原广泛存在于人体内，为各种组织提供强度和结构稳定，是骨的细胞外基质的主要有机成分。

1.1 小动物实验

小动物纤维环实验主要包括兔子和鼠模型，造模的方式主要包括单独穿刺、穿刺去除髓核以及纤维环切开术。早在2003年，日本的学者[7]将同种异体的椎间盘细胞接种在具有膜密封的透明胶原蜂窝状支架上，然后移植到受体兔的椎间盘中，术后12周，未治疗的受损椎间盘和经无细胞治疗的椎间盘丧失了椎间盘高度的50%，而异基因纤维环细胞负载的支架组丧失了椎间盘高度的20%。无细胞支架的组织学切片显示较小的细胞浸润和细胞外基质产生，而载有细胞的支架的切片显示，纤维环细胞能够在植入部位增殖并产生细胞外基质，其细胞外基质含量与完整对照相似，从而验证了同种异体纤维环细胞可以存活且具有软骨样增殖活性。将种子细胞与纤维环修复支架共培养后植入纤维环破口，借助植入细胞的再生长使纤维环破口得到生物学修复的方式主要集中于支架的制备、种子细胞的获取、微环境的优化等方面。2014年以来，Grunert等[8-10]发表了三项研究，即使用可注射的高密度胶原蛋白与核黄素交联，以修复鼠尾椎间盘中穿刺损伤的纤维环，与受损未经治疗的对照相比，该疗法可在术后18周内减轻脊柱退行性改变；与正常椎间盘相比，交联组的仅细胞外基质轻微减少，无椎间盘退变的迹象。因为核黄素可以改善高密度胶原蛋白的刚度，对修复纤维环起到积极作用，其中纤维环部分修复是由纤维帽桥接缺损完成。国内学者研究发现，用地塞米松磷酸钠溶液将同种异体骨髓来源的间充质干细胞注射到兔的椎间盘中，或者移植同种异体脂肪干细胞，可以起到改善受损纤维环修复的效果[11-12]，以及新起的脱细胞方案研究[13-14]，这两种细胞疗法的优势都是能够很容易的在临床实施，但缺点是从他们的结果来看，效果似乎并不那么令人满意。在小动物实验中，当使用组织学切片来鉴定对修复策略的免疫学反应时，由于体内时间短，可能未观察到明显的纤维环修复。

1.2 大动物实验

大动物模型主要在牛、猪、羊等体内完成，通常将纤维环进行穿刺损伤或切开再修复。近年来，生物分子和生物材料策略修复的研究成为热点，人们对利用生长因子或干细胞移植对椎间盘退变进行早期干预以补充病变组织的再生能力。有学者在绵羊椎间盘损伤模型中，将300µg骨形态发生蛋白注射到纤维环中，发现可以改变椎间盘组织的生长环境，减少细胞外基质蛋白的丢失[15]。骨形态发生蛋白在胚胎发育中起着重要的作用，临床上常用来增强脊柱融合，有遗传证据表明它在人类脊椎发育中起着重要的作用，或许它可以作为椎间盘再生修复研究的一个方向。Pennicooke等[16]在Grunert研究的基础上，利用胶原蛋白和核黄素溶液修复了绵羊腰椎的纤维环破损，与未治疗的受损椎间盘相比，胶原蛋白修补的椎间盘增加了髓核T2的弛豫时间，不过平均健康弛豫时间明显长于经治疗的椎间盘，从这看来，未来的研究将需要阐明修复技术和随访时间在组织学和放射学相关方面的作用。有研究[17]表明凝胶等修复材料可用于修复纤维环缺损，虽然可以恢复部分力学扭转范围改变，但单独应用时难以取得理想的效果。相比较而言，直接缝合与凝胶封堵一样仅仅完成了物理修复，不能实现再生生物医学的修复理念，但直接缝合在大动物实验中更具有优势。纤维环损伤后仅有最外层 1/3 的纤维环组织能够通过瘢痕形成的方式缓慢愈合。在动物缝合修补实验的研究中，杨洋等[18]取小牛腰椎标本制成50个脊柱功能节段，每个节段均在纤维环上作一10mm横切口。按照不同修复方法随机平均分为5组：粘合剂组、常规U型缝合组、改良荷包缝合组、粘合剂+U型缝合法组及粘合剂+改良荷包缝合组，然后进行纤维环抗静水压强度测试及疲劳测试，根据各组的泄露压力和极限转数来评价其修复效果，最后得出，应用粘合剂+改良荷包缝合法处理纤维环切口，具有较高的生物力学强度。王宇鹏等[19]探讨缝合法及医用纤维蛋白粘合剂法修复山羊腰椎间盘纤维环缺损的效果，发现缝合组修复处细胞超微结构优于粘合组、对照组，说明直接缝合法优于粘合法。虽然直接修复可恢复和维持椎间盘的微环境，但不能起到促进椎间盘再生的目的，对深层纤维环的修复作用有限。

上面描述的动物研究共同表明，使用生物修复策略可以在动物模型中实现成功的环形修复。虽然大型动物的机械性能研究不足，但是评估力学的研究表明，可以通过修复纤维环来恢复椎间盘完整的性能。理论上理想的动物模型来源是牛、猪、羊等哺乳动物，但是这些较为大型的动物费用高、麻醉困难，难以大量应用。鼠类小型实验动物的腰椎过小，进行椎间盘髓核穿刺纤维环缝合技术难度较大。新西兰大白兔虽为爬行动物不能完全模拟人类直立行走的腰椎间盘退变突出，但其饲养容易、腰椎间盘大小适中、麻醉简单，造模的可行性好，重复性强，是目前建立腰椎间盘髓核突出纤维环缝合较为理想的动物模型。

2 临床研究

腰椎髓核摘除术在临床广泛开展多年，已成为治疗腰椎间盘突出症的常规术式，术后多数患者症状可以改善，但复发率及二次手术率较高。椎间盘的节段性融合或假体置换，为改善症状提供了令人满意的短期结果，但这些技术创伤大、费用高，并且当脊柱的生物力学特性改变时，也会对邻近的水平产生潜在的不利影响[20]。已有的研究包括双极射频消融进行纤维环皱缩成型术、医用明胶海绵封闭纤维环切口、人工硬脊膜填充覆盖纤维环破损处、自体筋膜移植修补缺口、纤维环缝合术等在术中尝试将纤维环破口直接缝合或粘合，为修复纤维环提供了经验，但显然，临床上更需要一种破坏性较小的再生疗法来修复纤维环[8,21,22]。单纯的摘除术对破损的纤维环一般不做处理，此时纤维环的完整性被破坏，随着时间的推移，椎间隙变窄，椎间盘退变加重，稳定性就会越来越差。大量文献的系统回顾表明，单纯髓核摘除手术有较高二次疝出风险，需要进一步的手术治疗[23,24]，纤维环的缺损使椎间盘不再处于密闭环境，纤维环内压力、血运等一系列微环境改变均不利于椎间盘的修复和再生[6,25]。有效的纤维环修复可以显著改善LDH的手术结果，因此，纤维环修复技术不仅可提供物理屏障降低再疝率，改善生物力学，还有可能成为椎间盘再生研究策略的一部分。2013年，Bailey等[21]采用Xclose缝合摘除髓核的纤维环，纤维环修复组再突出率低于对照组，但长期随访无统计学差异，这种缝合方式临床上现在已经较为少用。经典的髓核摘除术其难点在于椎板间开窗后操作界面明显受限，常规手术器械难以进入骨窗内进行修补操作。其次，纤维环切开时多采用矩形切口，切开后缺损较大，张力大缝合困难，缝合后纤维环愈合效果不佳。有学者探讨微创小切口髓核摘除合并纤维环修补治疗腰椎间盘突出症的临床疗效，回顾性分析了92例腰椎间盘突出症患者，根据手术方式分为小切口髓核摘除合并纤维环修补组和单纯髓核摘除组，每组46 例，记录两组患者术前、术后2周及术后6、12、18个月的腰腿痛恢复情况，两组手术时间、术中出血量、手术并发症等无差异性，手术前后JOA评分以及MacNab标准进行疗效评定，微创小切口髓核摘除合并纤维环修补可获得良好的近期临床效果，纤维环修补组的复发率(2.17%)明显低于对照组(10.29%)，有效降低了腰椎间盘突出症术后复发及再次手术的风险。随着脊柱微创技术发展，显微内镜也运用到了纤维环缝合，显微内窥镜下椎间盘髓核摘除纤维环缝合术治疗LDH操作简便、安全可行，可获得满意的临床疗效，在严格把握适应证的条件下，可有效降低术后复发率及再手术率[26-28]。虽然内镜技术中出血量、术后卧床时间及恢复时间、住院时间方面优于传统开窗手术，但小切口摘除髓核组织，可以在直视下进行，其手术操作空间大，视野清晰，学习曲线和难度较微创手术降低。而微创手术，不管是椎间孔镜还是椎间盘镜，其通道狭小，不利于缝合器械的操作，学习曲线较高，器械较贵，不利于在基层医院开展。刘灿坤等[29-30]认为小切口髓核摘除术可达到手术野足够的暴露，便于纤维环缺损的修复，且不影响腰椎的稳定， 是目前治疗LDH有良好效果和较小创伤手术方式之一。

3 小结

随着动物实验和临床研究的更新改善，LDH手术外科技术逐渐提高。相应的纤维环修复对LDH手术患者复发率的影响开始受到广泛重视。作为临床脊柱外科医生，充分认识，理解纤维环修复的相关概念及干预手段，开展与基础、神经外科、影像科以及康复科的多学科讨论，可以帮助我们更好的调整治疗方案，最终目的是实现再生医学的发展理念。我们需要认识到临床上需要一种破坏性较小的再生疗法来修复纤维环，虽然现有的实验证据远远不足以提供临床修复纤维环的要求，但我们应该更加努力的开拓纤维环修复的探索研究，寻求多中心、多领域的合作是阐明纤维环修复的未来方向。