CRISPR/cas9基因编辑技术在羊毛品质改良中的应用

李忠慧

（新疆畜牧科学院生物技术研究所，乌鲁木齐 830000）

绵羊作为重要的家畜经济动物，羊毛是其主要的高附加值产品。羊毛是一种纯天然、可再生、可降解的绿色环保型纤维，具有天然的透气性及吸收、释放空气、湿气的独特能力。同时，由于羊毛纤维柔软有弹性，使得羊毛制品具有保暖性强、穿着轻柔等特点。澳洲美利奴羊毛作为世界上品质最好的羊毛，与其他羊毛相比，更为纤细柔软，毛色白而有光泽，富有弹性。随着我国国民经济的快速发展和居民收入水平的不断提高，居民消费能力不断提升，人们对羊毛等动物纤维服饰产品的需求量不断增长和对羊毛的质量要求也不断提高，我国已然成为羊毛生产加工大国和消费大国。但是由于我国的羊毛产量偏低、进口量大，羊毛细度、长度、毛色等品质不高，我国羊毛产业无法满足实际生产需求，培育和改良毛用绵羊品种以满足生产生活需求尤为重要。

在经济动物的品种培育过程中，现代生物技术手段有助于缩短育种时间、快速提高和改善动物生产性能。基因编辑作为现代生物技术的重要手段之一，是近年基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精准编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。在动物育种领域，由于传统育种手段的增产潜力已接近极限，利用高效稳定的基因编辑技术创新育种手段和提升现代动物育种效率及技术水平，对于育种新材料的创制和品种培育至关重要。

1 羊毛发育过程及其分子调控

羊毛生长的“发源地”是毛囊，毛囊作为哺乳动物皮肤重要的微型附属器官，其组织结构和性状决定了毛发的生长和品质。毛囊可分为两种不同类型，即初级毛囊和次级毛囊，一般认为初级毛囊生长毛，而次级毛囊生长绒。毛囊的发育可分为诱导期、器官发生期和细胞分化期三个时期[1]，依次经历形成毛囊基板、真皮凝集物、真皮乳头，最终形成完整成熟的毛囊、腺体和肌肉结构[2-3]。毛囊发育完成后，即进入周期性生长循环阶段，包括生长期（细胞快速增值、毛干快速生长）、退行期（细胞的增殖分化和毛干的生长趋于停滞）和休止期（细胞增殖停滞、毛干脱落）[4-5]。而毛囊的周期性生长发育过程受到复杂的分子网络调控。近年来，有关哺乳动物毛囊发育的调控机制研究已取得较大进展，研究发现，Hox 基因、BMP 基因、β-连环蛋白基因、KAP 基因以及Wnt 信号通路、Notch 信号通路、FGF 信号通路等均参与调控毛囊的生长发育，他们之间构成一个庞大复杂而又精准的基因网络调控图谱，每个基因之间紧密联系、相互制约，为毛囊发生及周期性循环提供必要保障。因此，在现代生物技术快速发展的时代，利用基因编辑等先进的技术手段研究调控毛发生长相关的功能基因，可为培育和改良毛用羊品种提供更多的科学支持。

2 CRISPR/cas9基因编辑技术

CRISPR/cas9 技术作为目前最流行的基因编辑技术，是人们从细菌和古细菌中发现的一把可以高效而精准地修改生命蓝图的利刃，是对靶向基因进行特定DNA 修饰的技术。该基因编辑技术系统主要由Cas9 核酸酶和sgRNA 组成。Cas9 核酸酶具有切割双链DNA 的活性结构域，使得双链DNA 断裂；sgRNA 是由起支架功能的tracrRNA 与特异性的crRNA 结合形成嵌合RNA。CRISPR/cas9 技术就像是一把“生物剪刀”，在sgRNA作用下通过RNADNA 碱基互补配对将Cas9/sgRNA 复合物靶向募集到目的基因，Cas9 再通过识别目的基因上的PAM序列（5'-NGG-3'）定点切割双链DNA，进而对目标基因定向删除、突变或插入新的基因片段，具有高效、快捷、精准、特异性高等特点。通过这一技术，不仅大大降低对动物进行基因敲除、基因修饰的难度，更是将动物转基因技术由传统的随机整合推向了高度精确的基因组定向删除、突变或插入，开创了转基因动物生产的新时代。因此，CRISPR/Cas9 基因编辑技术自出现以来，便快速地应用于绵羊等经济动物的基因编辑研究。

3 CRISPR/Cas9技术在羊毛品质改良中的应用

运用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑与羊毛生长性状相关的功能基因以获得基因编辑绵羊，该过程一般包括以下几个步骤：（1）利用sgRNA 在线设计软件，针对目标基因上的PAM序列（5'-NGG-3'）设计sgRNA，并合成sgRNA 序列；（2）制备合成Cas9 mRNA；（3）利用体外受精等技术获得受精卵；（4）利用显微注射技术将sgRNA 和Cas9 mRNA注射入受精卵内，并置于培养箱内培养受精卵；（5）将胚胎移植至受体母羊体内发育成长；（6）待羔羊出生后检测基因编辑情况。

已有研究发现，属于成纤维细胞生长因子FGFs（一类调节细胞生长的多功能肽类生长因子）家族成员之一的FGF5基因，被认为在毛发生长过程中抑制毛发的生长期，而突变FGF5基因则可导致毛囊生长期延长，促进毛发生长，从而提高羊毛产量、改善羊毛品质。因此，利用CRISPR/Cas9系统胚胎注射获得21只FGF5靶向编辑的陕北白绒山羊，对其绒长性状进行检测的结果表明，FGF5 基因靶向编辑的绒山羊的绒毛长度和密度等指标显著高于野生型绒山羊[6]；本课题组运用CRISPR/Cas9技术对中国美利奴细毛羊的FGF5 基因进行编辑，共获得16 只FGF5 基因功能失活的基因编辑羔羊，其中12只存活超过1年。羊毛性状检测结果表明，12 只基因编辑细毛羊的羊毛毛丛自然长度及其伸直长度显著长于同龄、正常野生型细毛羊，且产毛量显著高于野生型细毛羊[7]。另有研究发现，调节毛囊黑色素细胞合成褐黑素的ASIP 基因拷贝数或基因表达水平的变化能够改变细毛羊的毛色，通过CRISPR/Cas9技术编辑ASIP基因获得了不同颜色和毛色图案的彩色细毛羊[8]，证明修饰ASIP基因能够实现毛色的定向改变，是培育彩色细毛羊的一条有效、可行的技术途径。此外，除了FGF5 基因和ASIP基因，毛纤维性状相关基因的其他基因，如VEGF、Tβ4、PRL、LCE7A、MOGAT2、MOGAT3等基因均可通过CRISPR/Cas9技术进行精准编辑以制备和选育性状优良的绵羊品种。

4 展 望

传统的绵羊品种培育主要是通过基于表型选择的杂交改良等常规育种技术，虽在一定程度上取得了育种效果，但是这种育种手段周期长、预见性差、选择效率低，在培育新品种方面难度较大，而且在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求高。CRISPR/Cas9 基因编辑技术自出现以来，其高效、快捷、精准、特异性高的特点大大缩短育种时间，加快育种进程，同时为动物遗传育种、基因组学研究、疾病防控等方面提供了新的研究思路。但目前对基因编辑技术来说，最重要的还是能够合理利用和监管基因编辑，保障其安全性，推动社会生产。

5 小 结

羊毛细度、长度、毛色等品质的改良，在人类生活中使得人们有更多的机会选择舒适度更高、加工工艺更多样的羊毛产品，进一步满足了人类对高品质生活的追求。因此，利用CRISPR/Cas9 技术对羊毛相关目的基因进行定向精准编辑，将是提高羊毛产量和改善羊毛品质的一种有效的精准分子育种途径。