黄芪汤对重离子辐射（12C6+）所致大鼠放射性脑损伤的保护作用

颜春鲁 安方玉 刘永琦 苏 韫 张利英 李佳蔚王彩霞 王统香 王国文 李孟翰

1（甘肃中医药大学 兰州730000）

2（甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室 兰州730000）

3（敦煌医学与转化教育部重点实验室 兰州730000）

随着重离子（12C6+）放疗技术在临床肿瘤治疗中的广泛应用，其对肿瘤病灶周围正常组织产生的辐射损伤效应也日益受到研究者的关注。这种辐射损伤效应主要表现为DNA 损伤、细胞增殖或凋亡、基因表达改变、表观遗传学改变、炎症反应、致瘤性转化，甚至癌症形成等［1-3］。因而探明重离子辐射旁效应累及组织细胞、旁器官规律、发生机制及如何防治这种辐射损伤效应等具有重要意义。中药以低毒、高效、多靶点和整体调制等优势成为辐射防护研究的热点［4-6］。摘自《医学心悟》中的经方黄芪汤，主要由黄芪、熟地、麦冬、人参、枸杞子和五味子组成，全方具有益气滋阴，生津养血之效。本实验旨在探讨黄芪汤对12C6+离子束辐射所致大鼠脑损伤的保护作用及其机制，为临床辐射损伤的防护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wister大鼠50只，体质量（180±20） g雌雄各半，购自甘肃中医药大学科研中心，实验动物质量合格证号为SCXK（甘）2018-0005，所有动物自由饮水、摄食1 周。本实验经通过甘肃中医药大学科研中心实验动物伦理委员会的严格审查。

1.2 主要试剂

反转录试剂盒和实时荧光定量试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号分别为：H7806580、H7825350）；β-actin、Bcl-2、Bax、Caspase-3等引物 基 因 序 列 为： β -actin 上 游 引 物 5'-TGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3'，Size：22，下游引物5'-GGCAGTAATCTCCTTCTGCATC-3'，Size：25，片段长度105 bp；Bcl-2 上游引物5'-CTTCTTCCAGATGGTGAGTGAG-3'， Size： 22，下游引物5'-GTGGATGACTGAGTACCTGAAC-3'，size：22，片段长度125 bp ；Bax 上游引物5'-GATGGCCTCCTTTCCTACTTC-3'，size：21，下游 引 物 5'-CTTCTTCCAGATGGTGAGTGAG-3'，size：22，片段长度96 bp；Caspase-3 上游引物5'-CTTGGAAAGCATCCAGCAATAG-3'， size： 22，下游引物5'-ACTCAGCACCTCCATGATTAAG-3'，size：22，片段长度122 bp（上述引物均由TaKaRa 宝生物工程（大连）有限公司设计并合成）；兔抗大鼠Bcl-2 抗体（美国Gene Tex 公司，批号：42970）；兔抗大鼠Bax 抗体（美国Gene Tex 公司，批号：39988）；兔抗大鼠Caspase-3 抗体（美国Gene Tex公司，批号：42753）；GAPDH抗体（美国Gene Tex公司，批号：41323）。

1.3 药物及给药剂量

黄芪汤方中的所有药材均购自甘肃中医药大学附属医院，中药原药材均由本校甘肃省高校中藏药化学与质量研究室进行质量鉴定。黄芪汤由30 g黄芪、15 g熟地、15 g麦冬、15 g人参、15 g枸杞子和10 g五味子组成，人的临床用量为100 g/d，按照人与大鼠的体表面积换算法得出剂量（100 g×0.018×5=9.0 g/(kg·d)）作为中剂量，则黄芪汤高、中、低剂量分别为18.0 g/(kg·d)、9.0 g/(kg·d)、4.5 g/(kg·d)。

1.4 主要仪器

美国Q5000 超微量紫外可见分光光度计（上海在途生物科技有限公司）；PCR热循环仪（上海旦鼎国际贸易有限公司）；7500 型实施荧光定量PCR 扩增仪（上海兴曼生物科技有限公司）；Western-blot 分析仪（BIO-RAD）；BX53 型光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.5 动物分组及处理

SPF 级Wister大鼠自由饮水、摄食1 周后，按随机数字表法分为正常对照组，单纯辐射模型组，黄芪汤高、中、低剂量组，每组10 只。正常对照组和单纯辐射模型组给予等量生理盐水灌胃，黄芪汤高、中、低剂量组给予黄芪汤灌胃（剂量为18.0 g/(kg·d)、9.0 g/(kg·d)、4.5 g/(kg·d)），连续7 d。第8 天腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉各组大鼠，除正常对照组大鼠外，其余各组大鼠脑部均给予4 Gy12C6+离子束单次照射。重离子照射是在中国科学院近代物理研究兰州重离子加速器研究装置的浅层肿瘤治疗终端上所完成的，照射过程中的束流为12C6+离子束，具体照射方法参考文献［5］，采用坪区照射，照射过程中的能量为165 MeV，LET 为20 keV/μm，吸收剂量率为4 Gy/min，用空气电离室监测剂量，照射剂量为4 Gy。辐射后第7天称量各组大鼠的体质量，股动脉采血，处死大鼠，分离血清，摘取脑组织备用。

1.6 动物体质量及脑系数测定

辐射后第7天称量各组大鼠体质量，股动脉采血处死各组大鼠，用生理盐水冲洗脑组织并用吸水纸吸干后称重，计算大鼠的脑系数。大鼠脑系数（mg/g）=脑质量（mg）/大鼠体质量（g）。

1.7 脑组织病理改变观察

称重后的脑组织用手术刀片做冠状脑切片后放在4%多聚甲醛固定液中24 h，梯度乙醇脱水后二甲苯处理及常规石蜡包埋，60 ℃过夜后脱蜡、冲洗、苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察脑组织结构改变。

1.8 脑组织神经细胞凋亡测定

将适量脑组织制作冰冻脑片后用TUNEL 试剂盒进行染色，抗荧光猝灭封片液封片后在显微镜下观察切片，随机各选择5 个×100 视野区域，每个视野区域至少包含30 个细胞；使用Image proplus 6.0 软件分析对每个视野范围内的总细胞个数和凋亡细胞个数进行计数。细胞凋亡百分率（%）=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%。

1.9 脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达测定

脑组织RNA 提取用4 ℃的Trizol 试剂，提取后立即上机测定RNA 含量和OD260/OD280的比值。RT-PCR 法合成模板cDNA 后，以cDNA 为模板进行PCR扩增反应，具体反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性40 s，58 ℃退火50 s，60 ℃延伸2 min。共42 个循环。实验过程中每个样品至少设置3 个复孔，以β-actin基因为内参基因，用2-△△Ct来表示基因相对表达含量。

1.10 脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达测定

脑组织总蛋白的提取用4 ℃的RPMI 裂解液。BCA 法测定各样品的蛋白含量，将所有的样品用裂解液稀释成4 mg/L，取10 μL 与4×上样缓冲液混匀，调整蛋白进样浓度为40 μg/10 μL。点样后经过SDS-PAGE 电泳、转膜，封闭液封闭等过程，加兔抗大鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3 和GAPDH 等一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3～4 次，二抗室温孵育2 h 后TBST 洗膜3～4 次。电化学发光液化学发光显影、定影后用Western-blot 分析仪进行图片采集与拍照。蛋白条带灰度值用Image J 图像分析软件进行处理与分析，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白条带的灰度值/内参蛋白条带的灰度值。

1.11 数据的统计与处理

所有实验数据经过SPSS 22.0 软件分析，所得结果用“±s”表示，组别之间的差异分析方法采用One-Way-Anova，p＜0.05 为有显著性差异，p＜0.01为有极显著性差异。

2 结果

2.1 脑系数测定

单纯辐射模型组大鼠体质量和脑系数均显著降低（p＜0.01）；黄芪汤中、高剂量组大鼠脑系数显著升高，并且其高剂量组体重也显著升高（p＜0.05），见表1。

表1 各组动物体质量及脑系数检测结果Table 1 The weight and the cerebral coefficient in each group (±s,n=10)

表1 各组动物体质量及脑系数检测结果Table 1 The weight and the cerebral coefficient in each group (±s,n=10)

注：1p＜0.05，2 p＜0.01，与单纯辐射模型组比较。Note: 1p＜0.05, 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

脑系数/(mg∙g−1)Cerebral coefficient 7.50±0.772 4.84±0.48 6.82±0.381 6.61±0.331 5.98±0.43组别Group正常对照组Normal control group单纯辐射模型组Radiation alone model group黄芪汤高剂量组Huangqi decoction high-dose group黄芪汤中剂量组Huangqi decoction middle-dose group黄芪汤低剂量组Huangqi decoction low-dose group体质量/g Body mass 235.09±19.912 174.37±17.02 224.34±21.731 198.44±15.18 187.36±20.99

2.2 观察脑组织病理形态学改变

正常对照组大鼠脑组织神经细胞排列整齐、规则，形态结构正常；单纯辐射模型组大鼠脑组织排列疏松，神经细胞数量减少，神经细胞核固缩、深染，血管周围间隙增宽，神经细胞周围间隙增宽；黄芪汤低、中剂量组脑组织排列疏松，神经细胞数量减少，血管周围间隙增宽；黄芪汤高剂量组脑组织排列疏松及神经细胞数量减少等情况较单纯辐射组明显好转，但未完全恢复正常，见图1。

2.3 脑组织神经细胞凋亡率测定

单纯辐射模型组和黄芪汤低剂量组大鼠脑组织的神经细胞发生明显凋亡现象，黄芪汤中、高剂量组大鼠脑组织的神经细胞凋亡现象明显减轻，但未恢复到正常组水平。单纯辐射模型组大鼠脑组织的神经细胞存在大量凋亡细胞（p＜0.01）；黄芪汤中、高剂量组的脑组织细胞凋亡百分率显著降低（p＜0.01）。见图2和图3。

2.4 脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达测定

单纯辐射模型组大鼠脑组织Bcl-2 基因表达显著降低，Bax 和Caspase-3 基因表达显著升高（p＜0.01）；黄芪汤中、高剂量组大鼠脑组织Caspase-3基因表达显著降低，黄芪汤高剂量组大鼠脑组织Bax 基因表达也显著降低，Bcl-2 基因表达显著升高（p＜0.01）。见表2。

表2 各组动物脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达的检测结果Table 2 Gene expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10）

表2 各组动物脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3基因表达的检测结果Table 2 Gene expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10）

注：2 p＜0.01，与单纯辐射模型组比较。Note: 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

Caspase-3(2-ΔΔCt)0.27±0.092 1.03±0.05 0.44±0.052 0.46±0.112 1.12±0.17组别Group正常对照组Normal control group单纯辐射模型组Radiation alone model group黄芪汤高剂量组Huangqi decoction high-dose group黄芪汤中剂量组Huangqi decoction middle-dose group黄芪汤低剂量组Huangqi decoction low-dose group Bcl-2(2-ΔΔCt)2.67±0.412 1.05±0.07 2.03±0.152 1.10±0.17 1.04±0.19 Bax(2-ΔΔCt)0.35±0.062 1.08±0.02 0.44±0.072 1.05±0.20 1.27±0.15

2.5 脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达测定

单纯辐射模型组大鼠脑组织Bcl-2 蛋白量表达显著降低，Bax 和Caspase-3 蛋白表达量显著升高（p＜0.01）；黄芪汤中、高剂量组大鼠脑组织Caspase-3 蛋白表达量显著降低，黄芪汤高剂量组大鼠脑组织Bax 蛋白表达量也显著降低，Bcl-2 蛋白表达量显著升高（p＜0.01）。见表3和图4。

表3 各组动物脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白灰度值的检测结果Table 3 Protein expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10)

表3 各组动物脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白灰度值的检测结果Table 3 Protein expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-3 in brain tissues in each group (±s，n=10)

注：1p＜0.05，2 p＜0.01，与单纯辐射模型组比较。Note: 1p＜0.05, 2 p＜0.01,compared with the radiation alone model group.

Caspase-3(OD)0.32±0.042 0.69±0.09 0.40±0.082 0.47±0.052 0.74±0.02组别Group正常对照组Normal control group单纯辐射模型组Radiation alone model group黄芪汤高剂量组Huangqi decoction high-dose group黄芪汤中剂量组Huangqi decoction middle-dose group黄芪汤低剂量组Huangqi decoction low-dose group Bcl-2(OD)0.87±0.092 0.35±0.05 0.45±0.031 0.38±0.03 0.34±0.04 Bax(OD)0.13±0.012 0.56±0.04 0.21±0.022 0.54±0.08 0.63±0.10

3 讨论

重离子辐射发病过程具有急、猛、快、多，广等特点，继而引起机体各脏腑功能紊乱、气血阴阳失调等恶候，兼挟火热痰瘀、迁延难愈，其引发的病理演变过程符合毒邪致病的特点，因此，中医学将其归属于“毒邪”的范畴［7-9］。机体受辐照后不仅可耗损人体正气，还使体内火热毒邪亢盛，严重耗损津液。因此，中医认为火、瘀、虚是辐射损伤的基本病机［10］。根据辐射损伤的基本病机，中医药防护辐射损伤以培元固本、益气滋阴、活血散瘀为基本治则。黄芪汤方中，熟地、枸杞子，滋阴补肾；五味子，益气生津，滋肾养阴；麦冬，润肺养阴；黄芪，补中益气；人参大补元气，补脾益肺，生津养血。诸药合奏发挥益气滋阴，生津养血之功效，使得“正气存内，邪不可干”，起到防护辐射损伤的作用。

研究表明，辐射损伤最早期的生物学效应是细胞凋亡［11］。Bax、Bcl-2 和Caspase-3 是调控细胞凋亡的重要蛋白。Bcl-2是属于Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，Bax 是属于Bcl-2 家族的促凋亡蛋白，Caspase-3是Bcl-2家族通过线粒体途径调控细胞凋亡的下游促凋亡蛋白［12-14］。在线粒体凋亡调控通路中，当Bax形成Bax-Bax同源二聚体时会促进细胞凋亡，当Bax 形成Bax-Bcl-2 异源二聚体时会抑制细胞凋亡［15］。重离子辐射会激活机体受损组织的Bax过度表达，过度表达的Bax可通过线粒体途径激活下游的Caspase-3，激发Caspase 发生级联反应，促进受损组织的细胞凋亡［16］。但是，重离子辐射同时又会抑制机体受损组织Bcl-2 的过度表达，使Bax 无法与Bcl-2 形成异源二聚体，从而无法抑制Bax 蛋白对线粒体下游Caspase-3 的激活，进一步促进了Caspase的级联效应，促进受损伤组织的细胞凋亡［17-18］。

本研究结果显示，4 Gy12C6+离子束照射大鼠脑组织后，单纯辐射模型组大鼠体质量及脑系数在照射后第7 天均显著降低，并且其脑组织的Bcl-2的基因表达和蛋白表达也在照射后第7 天显著降低，而脑组织的神经细胞凋亡率明显增加，Bax和Caspase-3 的基因表达和蛋白表达则在照射后第7天显著升高。脑组织病理形态显示，单纯辐射模型组大鼠脑组织排列疏松，神经细胞数量减少，神经细胞核固缩、深染，血管周围间隙增宽，神经细胞周围间隙增宽。说明12C6+离子束辐照后，凋亡相关蛋白Bax 过度表达和Bcl-2 过度抑制会促进线粒体凋亡通路激活，激活Caspase 的级联反应，从而促进脑组织的神经细胞发生凋亡，进一步加重脑组织的病理形态损伤（见图5）。

而在12C6+离子束照射大鼠脑组织之前预先给予黄芪汤干预1周，结果发现，黄芪汤中、高剂量组的脑系数显著升高，而脑组织神经细胞凋亡率明显降低，Caspase-3 的基因表达和蛋白表达均显著降低；黄芪汤高剂量组体质量及脑组织Bcl-2 的基因表达和蛋白表达均升高，而其Bax的基因表达和蛋白表达均显著降低。脑组织病理结果显示，黄芪汤高剂量组脑组织排列疏松及神经细胞数量减少等情况较单纯辐射组明显好转，但未完全恢复正常。说明黄芪汤的干预机制可能是通过抑制Bax过度表达和促进Bcl-2 过度表达来抑制线粒体凋亡通路激活，抑制Caspase 的级联反应，从而抑制受12C6+离子束照射脑组织的神经细胞发生凋亡，进而缓解脑组织的病理形态损伤，发挥抗辐射作用（见图6）。

综上所述，黄芪汤中的黄芪、熟地、麦冬、人参、枸杞子和五味子通过益气、生津、养血和滋阴等发挥抗辐射作用，具体机制可能是通过抑制线粒体凋亡通路来实现的。