脲酶—谷氨酸脱氢酶法快速测定黄酒及其发酵液中的尿素

高红波 仇 凯 李国辉 吴 刚 屠振华 郑 淼 陈楠楠 钟其顶*

(1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京 100015；2.全国食品发酵标准化中心，北京 100015;3.食品行业生产力促进中心，北京 100062)

黄酒是我国民族特产,含有丰富的营养组分深受广大人民的喜爱，与啤酒、葡萄酒并称世界三大古酒。随着人们对食品安全的日益关注以及对发酵酒安全性的重视，研究发现黄酒中含有氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate，EC，又叫Urethane)[1,2]，EC是一种多点致癌物广泛存在于发酵食品,[3,4]，已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入人类潜在致癌物质(2A 类),加拿大、美国、联合国粮农组织等已对酒精饮料中EC的含量规定了限量标准[1]，我国尚未制定酒中EC的限量标准。研究表明，黄酒中含有的尿素是形成氨基甲酸乙酯最主要的前体物质[1]，国家标准GB/T 34266—2017《黄酒中氨基甲酸乙酯预防控制措施指南》及文献中指出黄酒中 EC 主要源尿素与乙醇反应，且EC生成速率与其尿素含量，贮存时间 温度正相关[5-9]，因此建立黄酒及发酵过程中尿素的准确快速检测方法，对开展降低黄酒中EC含量的控制措施具有重要的意义。

目前，发酵酒中尿素的检测方法主要有化学比色法[10-13]，柱前衍生-液相色谱荧光法法[14-18]分离和液相质谱法[19]和脲酶法，即尿素经脲酶水解后产生氨和二氧化碳，通过检测氨或二氧化碳测定尿素含量[20-22]。其中化学比色法需水浴加热，操作繁琐，且易受黄酒中共存组分干扰；高效液相色谱法测定周期较长，无法满足黄酒酿造过程中尿素含量呈动态变化快速测定；酶法特异性好、速度快，适合对黄酒及发酵液中尿素快速监测，但是黄酒中内源氨是尿素含量的6～10倍左右，根据黄酒中尿素的测定原理，内源氨严重干扰尿素的测定[23]。

本实验筛选不同的类型的离子交换树脂，开展离子交换树脂除去黄酒中内源氨的研究，对离子交换树脂的洗脱液种类、洗脱液体积和洗脱液pH值等条件进行了选择和优化，最终确定离子交换树脂最佳前处理条件，可除去90 %的内源氨，消除了氨对尿素测定的干扰。将该前处理方法与脲酶-谷氨酸脱氢酶法结合，对黄酒及其酿造过程发酵液中的尿素进行了检测，并与柱前衍生高效液相色谱-荧光法[17]进行对比，通过方差分析和T检验说明两种方法测定结果无显著性差异，为适黄酒企业快速监控黄酒和黄酒酿造过程尿素含量提供了一个有效途径。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Arena 20XT全自动生化分析仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；高效液相色谱仪(Waters2695配荧光检测器)；液相色谱柱(美国Waters公司，Atlantis dC18 (250 × 4.6 mm, 5 μm)，分析天平(梅特勒，感量0.0001g)；漩涡混合器(太仓市科教器材厂)；玻璃层析小柱(22×1.5(内径)cm)定制。

1.2 试剂和耗材

3种强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(001×1、001×7、001×14.5，天津南开和成科技有限公司)；氨试剂盒、尿素试剂盒均为赛默飞世尔(中国)科技有限公司；乙腈(色谱纯)、9-占顿醇(美国Sigma公司)、尿素(纯度99%，美国百灵威化学试剂公司)、硫酸氨、氢氧化钠、浓盐酸均为分析纯；黄酒及黄酒酿造过程为黄酒厂家提供，水为二次蒸馏水。

1.3 实验原理

首先一分子的尿素((NH2)2CO)在脲酶(Urease)的催化作用下转化为二分子的氨离子(NH4+)，见反应(1)；随后氨离子(NH4+)与酮戊二酸(2-oxoglutarate)在谷氨酸脱氢酶(GLDH)的催化作用下转化为L-谷氨酸(L-Glutamate)，同时等摩尔数的NADH转变成NAD+，见反应(2)，为了减去样品中原来含有的游离氨，需同时对样品中游离氨进行检测，游离氨的检测单独使用氨试剂盒，只经过反应(2)。Arena分析仪通过分光光度法测定NADH在340nm波长下的吸光度变化，即可得出氨的浓度，随后根据公式(3)计算出相对应的尿素的含量。

(1)

(2)

由于1 mol尿素分解得到2 mol氨离子，其分子量比值为：MW(尿素/氨)=60.06/(2×18)=1.668，分解得到的氨离子和溶液中的氨离子按照实验方法测定，测得的总氨离子含量扣除溶液中的游离氨离子浓度，尿素含量的结果是通过分析仪自动运行以下公式实现的：

尿素(mg/L)=(总氨离子(尿素分解氨和游离氨)(mg/L)-游离氨(mg/L))×1.668

(3)

1.4 实验方法

1.4.1标准储备液和定标液的配制

尿素标准溶液配制：准确称取0.1000g尿素，用水溶解后定容至100mL，配制成尿素标准储备液(1000 mg/L)于4 ℃冷藏，准确吸取该标准储备液50 μL，用水稀释至1000 μL，得50 mg/L尿素定标液。

氨根标准溶液配制：准确称取0.3677g硫酸氨，用水溶解并定容至100 mL，根据硫酸氨和氨根离子的分子量，换算成氨根离子浓度为1000mg/L标准储备液于4 ℃冷藏。准确吸取该标准储备液50 μL，用水稀释至1000 μL，得50 mg/L氨根离子作为定标液，定标液现配现用。其中硫酸氨((NH4)2SO4)分子量是132.14，氨根的相对分子量是18，因此硫酸氨质量浓度与氨根质量浓度的转换系数为：C氨=C硫酸氨×36/132.14=C硫酸氨×0.272。

1.4.2样品前处理

强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂(001×1型树脂)用水浸泡24小时，用2倍树脂体积的4%盐酸，通过树脂层，并浸泡2～4小时，用去离子水通过树脂层，洗至出水酸度稳定pH 2～3；用2倍树脂体积的2 %氢氧化钠溶液，通过树脂层，并浸泡2～4小时，用去离子水通过树脂层，洗至出水酸度稳定pH 8～10。反复3次后，用4 %的盐酸将Na型树脂转换为H型树脂即可使用。将处理好的阳离子交换树脂装入离子交换柱(22×1.5(内径)cm)中，柱高2.5 cm。取10 mL黄酒样品加入离子交换柱内，收集流出液，分次用纯净水洗脱(每次1 mL)，收集20 mL，混匀，取1 mL进样测定。

1.4.3Arena20XT全自动生化分析仪测定参数

氨根测定采用氨试剂盒。根据仪器的测定条件，进样量：5μL；试剂1：100μL；试剂2：25μL；试剂3：25μL；加入试剂2孵育300s，读取空白值；加入试剂3孵育360s，读终点。测定波长：340nm；反应温度：37℃。

尿素的测定采用尿素试剂盒，其他测定条件同氨。

1.4.4定标

取1mL超纯水、1mL含尿素50mg/L的定标液置于样品架上，按仪器设定参数定标，定标类型：线性；重复时间：1天；定标各点重测次数：2次。

1.4.5样品测定

取待测样品1mL，置于样品架各个样品位上，按照仪器的使用规程和参数设定进行检测，自动计算结果。

2 结果与讨论

2.1 氨对尿素测定的干扰

脲酶-谷氨酸脱氢酶法的原理是尿素在酶的作用下分解产生的氨，Iiday[23]研究报道黄酒及黄酒发酵液内源氨含量是尿素含量的6～10倍，会对尿素的测定有干扰，本实验对黄酒中氨含量对尿素的测定干扰情况进行了研究。固定尿素的含量，分别配制氨浓度为尿素浓度的1、2、6、10、12、15倍的混合溶液，按实验方法测定，从图1可以看出，当氨浓度是尿素浓度的6倍时(C氨/C尿素=6)，尿素的回收率为119%，当氨浓度是尿素浓度的10倍时(C氨/C尿素=10)，尿素的回收率超过140%以上，随着C氨/C尿素比值增加，尿素的回收率增加，而氨根离子的回收率基本都在100%左右，实验结果表明：当氨浓度超过尿素浓度的6倍以上对尿素的测定产生正干扰，本研究结果和文献报道基本一致，因此，采用脲酶-谷氨酸脱氢酶法测定黄酒中尿素需要首先除去黄酒中高含量的游离态的氨根离子。

图1 氨对尿素测定的干扰研究

2.2 前处理方法的优化

本实验对离子交换树脂种类、洗脱液种类、洗脱液体积和洗脱液pH值等条件进行了选择和优化。

2.2.1阳离子交换树脂类型比较

采用6 mg/L的尿素标准品(含60 mg/L氨)，按照1.4实验方法比较001×1、001×7、001×14.5.3种阳离子交换树脂的除氨效果，001×7和001×14.5 两种树脂的氨除去率均为100 %，但尿素回收率分别为68.14 %和17.35 %，均偏低，说明对尿素有一定吸附；001×1树脂的氨除去率为89.29 %，尿素回收率为96.78 %，该树脂除氨效果理想且对尿素影响较小,结果见图2样品前处理方法优化(A)，因此本方法最终选择001×1强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。

2.2.2洗脱液的选择

尿素易溶于水，可溶于乙醇，甲醇等有机溶剂，在酸性、碱性以及加热条件下水解。选择尿素的洗脱液优先考虑水，本实验按照实验方法采用纯水、50 %乙醇、80 %乙醇和90 %乙醇4种洗脱液，根据黄酒中尿素的加标回收率比较洗脱液的效果，从图2样品前处理方法优化(B)中可见纯水洗脱液效果最佳。

2.2.3洗脱液体积的选择

采用5、8、10、15 mL不同体积的二次蒸馏水分别为洗脱液，对10 mg/L尿素加标酒样做回收率实验。实验结果表明洗脱体积为5mL时尿素未完全洗脱，洗脱体积为10 mL时，可以满足洗脱需要，继续增大洗脱液体积，回收率没有明显变化，确定洗脱剂用量为10 mL,见图2样品前处理方法优化(C)。

2.2.4洗脱液pH的比较

黄酒的pH在3～4之间，氨在酒样中以离子形式存在，用pH3.5、pH5.5、pH 7.5、pH 8.5水洗脱液对10 mg/L加标黄酒样进行洗脱，通过回收率实验测定洗脱效果，从图2样品前处理方法优化(D)可以看出用二次蒸馏水(pH5.5)即可满足测定要求。

图2 样品前处理方法优化

2.3 方法学考察

2.3.1线性范围和检出限

配制系列2.0、5.0，10、25.0、50.0 mg/L的尿素标准溶液，按照Arena 20 XT 仪器设定的条件进行测定，以测定响应值(y)对浓度(x)作标准曲线图，计算线性回归方程，尿素在2.0～50.0mg/L 浓度范围内线性关系良好，相关系数(r)为0.999，见表1。用Arena 20 XT 仪器测定尿素空白溶液20次，按照AOAC推荐的方法[24]，计算得本方法对尿素的检出限为0.47 mg/L和定量限为2.23mg/L见表1。

表1 线性范围、检出限

2.3.2方法的加标回收率

分别向成品黄酒和黄酒生产过程发酵液中加入高、中、低3个不同浓度梯度的尿素标准液，按照实验方法测定并计算回收率，成品黄酒的回收率在101.3 %～107.4 %之间，黄酒生产过程发酵液的回收率在100.3 %～109.1 %之间，结果见表2。

表2 脲酶-谷氨酸脱氢酶法测定黄酒及黄酒生产过程发酵液中尿素的加标回收率(n=3)

2.3.3方法的精密度

对同一样品取10份按本方法分别测定，计算成品黄酒和黄酒过程样的重复性RSD%,分别为2.62%和3.51%；结果分别见表3。

表3 尿酶法对葡萄酒中尿素含量的精密度测定结果(n=10)

2.4 脲酶-谷氨酸脱氢酶法与液相色谱法测定尿素的结果比较

分别用本实验方法脲酶-谷氨酸脱氢酶(Urease-GLDH)和QB/T 4710—2014，发酵酒中尿素测定方法高效液相色谱法[17]两种方法处理并测定黄酒成品酒和黄酒生产过程发酵液中尿素含量，结果见表4。

表4 Urease-GLDH和HPLC-FLD法对黄酒及黄酒生产过程发酵液中尿素测定结果的比较

对表4中数据进行方差分析(表5)，P0.05=0.891>0.5；F=0.1980.5。以上分析说明两种方法测定无显著性差异，经与QB/T 4710-2014 HPLC-FLD法对比实验表明，Urease-GLDH法检测黄酒及黄酒发酵液中的尿素具有较高准确性。将国标HPLC-FLD和Urease-GLDH两种方法的相关参数进行对比(表7)，可以得到：

表5 两种方法测定结果方差分析

表6 两种方法测定结果T检验表

表7 Urease-GLDH法与HPLC-FLD法对比结果

(1)HPLC-FLD和Urease-GLDH两种方法都具有良好的回收率、精密度和重复性，可满足黄酒生产过程尿素监控的要求，且Urease-GLDH成本更低，操作简单，所用试剂基本无毒无害；

(2)HPLC-FLD相对Urease-GLDH法具有较高的灵敏度，而Urease-GLDH法测定黄酒样所需平均时间17min,测定速度较HPLC法提高近4倍，黄酒生产过程中尿素含量处于不断变化的状态，因此从快速监控的角度考虑，Urease-GLDH法更适合于黄酒生产过程发酵液中尿素的快速测定。

3 结 论

本研究对除去黄酒中内源性的氨根离子的前处理方法进行了系统研究，对比不同离子交换树脂除氨的效果、选择了强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，并对洗脱液种类、体积和pH值等主要影响因素进行了选择优化，研制的阳离子交换树脂可除去黄酒中近90 %的氨，消除氨对尿素测定的影响，实现了酶法快速测定黄酒及黄酒生产过程发酵液中尿素，本方法前处理简单，方法易于掌握，且不需使用乙腈等有机化学溶剂，与液相色谱法相比，测定效率提高近4倍，可供酿酒企业进行黄酒产品及生产过程中尿素的快速监控，为开展黄酒中质量安全过程监控提供一种快速的分析测试方法。