高效液相色谱法测定食用油中9种抗氧化剂

晁桂梅

(上海市崇明食品药品检验所/崇明食品安全检测中心，上海 202150)

食用油是我们生活中的必需品之一，但油脂极易被氧化，不宜长时间储存。氧化不仅会使食用油退色、变色，而且还会破坏食用油中的维生素等营养物质，进而降低食用油的感官品质和营养价值，使其变质，甚至产生有害物质，引起食物中毒等现象。食品抗氧化剂是能阻止或延缓食品氧化变质、提高食品稳定性和延长贮存期的食品添加剂[1]。目前，食品抗氧化剂在食用油中的使用极为广泛，常用的食品抗氧化剂种类包括有人工合成的叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲基苯酚(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等物质。这些抗氧化剂都是有效的自由基吸收剂，能吸收氧化产生的自由基，阻断自由基链锁反应，将油脂被氧化产生的自由基转变为稳定的产物，消除脂类氧化的自由基反应，进而中止脂类的氧化反应[2]。现行国家标准[3]及文献报道多采用气相色谱法[4，5]、气相色谱-质谱法[6，7]、高效液相色谱法[8-11]以及液相色谱-质谱法[12，13]测定食品中抗氧化剂含量，本研究选择高效液相色谱法，与现有报道相比[14-15]，可以同时测定食用油中9种抗氧化剂，且具有操作简便、分析速度较快、检测灵敏度高等优势。

本研究以食用油为试验材料，用正己烷溶解，乙腈提取，固相萃取柱净化后，通过高效液相色谱法测定，外标法定量，得到同时测定食用油中9种抗氧化剂的色谱条件，并进行加标回收试验，以验证本方法的准确度和精密度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱(美国安捷伦公司)；涡旋振荡器、离心机、氮吹仪(美国Thermo Scientific)；电子天平(美国梅特勒-托利多国际有限公司)；乙腈、正己烷、甲醇(色谱纯，上海安普科技股份有限公司)；无水硫酸钠(分析纯，天津化工有限公司)；C18固相萃取柱 2000 mg/12mL、0.22 μm微孔有机系滤膜(上海安普科技股份有限公司)；食用油(市售)。

9种抗氧化剂标准物质的信息如表1所示。抗氧化剂标准物质混合储备液：准确称取0.1 g(精确至0.1 mg)固体抗氧化剂标准物质，于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，配制成浓度为1000 mg/L 的标准混合储备液，0℃～4℃避光保存。移取适量体积的浓度为1000 mg/L的抗氧化剂标准物质混合储备液分别稀释至浓度为5、10、20、50、100、200、400 mg/L的系列混合标准使用液。

表1 9种抗氧化剂标准物质信息

1.2 试验方法

称取1 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中，加入400 μg/mL的混合标准溶液500 μL，加入5 mL乙腈饱和的正己烷溶液溶解样品，涡旋1 min，静置10 min，用5 mL正己烷饱和的乙腈溶液涡旋提取2 min，3000 r/min离心5 min，收集乙腈层于试管中，再重复使用5mL正己烷饱和的乙腈溶液提取2次，合并3次提取液，待净化。在C18固相萃取柱中装入约2 g的无水硫酸钠，用5 mL甲醇活化萃取柱，再以5 mL乙腈平衡萃取柱，弃去流出液。将所有提取液倾入柱中，弃去流出液，再以5 mL乙腈和甲醇的混合溶液洗脱，收集所有洗脱液于试管中，40℃下旋转蒸发至干，加2 mL乙腈定容，过0.22 μm 有机系滤膜，供液相色谱测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：XDB C18(Agilent，5 μm，0.46×25 cm)；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；柱温：35℃；流动相A：0.5%甲酸水溶液，流动相B：甲醇，流动相C：乙腈，洗脱程序如表2所示；检测器：VWD；检测波长：280 nm；定量方法：外标法。

1.4 数据处理

采用Agilent 1260自带化学工作站C.01.07.[27]及Excel软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 流动相比例及洗脱程序优化

在保持色谱柱、流速、进样量、柱温、检测器及检测波长不变的条件下，通过不断调整流动相比例及洗脱程序，改善了9种抗氧化剂的分离度和灵敏度，优化洗脱程序后得到的具体参数如表2所示。该洗脱程序条件下，9种抗氧化剂的分离度均大于1.5，且灵敏度较高。在此洗脱程序的基础上，若继续增加21～29 min时间段甲醇和乙腈流动相的比例，会导致分离效果不佳，其中BHT与DG的分离度小于1.5，达不到分离要求；若继续增加21～29 min时间段甲醇和乙腈流动相的比例，虽然分离度有所改善，但部分目标物的响应值明显有所下降，其中同等浓度下TBHQ的峰面积降至原来的90%，且BHT及DG目标峰的半峰宽变大，峰高变小，峰型变差。比较得出，采用表2中的参数作为本试验的色谱条件，得到9种抗氧化剂混合标准溶液的色谱图如图1所示。

图1 9种抗氧化剂混合标准溶液色谱图

表2 流动相比例及洗脱程序

2.2 线性方程、检出限、定量限

采用1.3及表2中洗脱程序作为色谱条件，依次测定浓度为5、10、20、50、100、200、400 mg/L混合标准系列工作溶液，以相应目标化合物的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制9种抗氧化剂的标准曲线，得到各项目的线性回归方程和相关系数，并参照GB 5009.32-2016[3]，以各目标峰的信噪比S/N≥3和S/N≥10分别确认9种抗氧化剂的检出限和定量限(见表3)。

表3 9种抗氧化剂标准曲线线性方程、检出限和定量限

2.3 加标回收率和精密度

选择不含上述9种抗氧化剂的空白食用油样品，准确添加质量浓度分别为20和200 mg/kg 两个浓度点的混合标准溶液，各做6份平行试样，按1.2样品处理方法进行处理，测定2个浓度、6个平行的加标回收试验，表4为计算得到的加标回收率和精密度。

表4 食用油中9种抗氧化剂加标试验回收率和相对标准偏差(n=6)

表4可知，两种基质中9种抗氧化剂两个浓度点6个平行的加标回收率平均值在 92.4%～110.0% 之间，相对标准偏差0.1%～4.8%之间，其准确度和精密度均满足实验室及国家标准GB 5009.32-2016[3]测定要求。

3 结论

本试验建立的同时检测食用油中9种抗氧化剂的高效液相色谱法，与GB 5009.32-2016国家标准方法相比，改变了流动相洗脱梯度，降低了除PG外的8种抗氧化剂的检出限，及9种抗氧化剂的定量限，提高了检测的灵敏度。该方法能有效去除基质干扰，在线性范围、分离度、准确度和精密度等方面均满足日常检测要求。