MicroRNA调控骨髓间充质干细胞成骨分化研究进展

马林，滕兆伟，陆声

(昆明医科大学解放军联勤保障部队第九二〇医院临床学院，云南 昆明 650032)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是最常见的骨骼疾病，是一种以骨量低、骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折的全身性骨病[1]。随着人口老龄化，OP已经成为全世界关注的健康问题。有报道称在2006—2007年间全世界有2亿妇女受骨质疏松症影响，每年造成890多万例骨折，每3 s即发生1次骨质疏松性骨折[2]。然而目前对OP的发病机制认识仍然有限。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类具有自我更新能力的多能干细胞，该细胞可以在体外培养并可以通过不同诱导液诱导为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型[3]。有研究表明与年龄有关的骨质疏松症与成骨细胞减少和骨髓中脂肪组织累积增加有关[4]，因此，深入了解BMSCs成骨分化与成脂肪分化的分子机制对于了解OP的发病机制具有重要意义。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是一类内生的、长度为20～29 nt的非编码小RNA[5]，自从Lee等[6]首次发现miRNA以来，越来越多的miRNA被人们所熟知。目前研究发现人类编码miRNA的基因约占总基因的3%，然而这些少量的miRNA所调控的人类编码基因却占了总数的40%～90%，广泛影响着细胞增殖、分化、凋亡等疾病的发生发展[7]。研究表明多种miRNA参与BMSCs的分化[8]，由于miRNA体积小，易于进入细胞，因此被认为是未来治疗OP的潜在方法。本文将对BMSCs成骨分化过程中涉及的主要四个信号通路Wnt、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)及Notch信号通路作一概述。

1 MiRNA调控BMSCs成骨分化信号通路机制

信号通路是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促反应通路，在最近几十年的深入研究中，已经证实了多种miRNA参与BMSCs的成骨分化过程，越来越多的研究表明miRNA通过调控关键转录因子及信号通路，影响着BMSCs的成骨分化过程，各个信号通路存在着联系，但目前关于这方面的报道相对较少。

1.1 Wnt信号通路 Wnt家族是由19种具有分泌功能的糖蛋白组成，参与各种生命活动过程，如细胞增殖、凋亡、间充质干细胞的分化，包括依赖于β-catenin的经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典的Wnt信号通路[9]。Wnt蛋白通过与Frizzled受体及LPR5/6受体集合抑制β-catenin磷酸化，非磷酸化的β-catenin进入细胞核内调节靶基因的表达[10]。越来越多证据表明，Wnt/β-catenin信号通路具有刺激成骨分化而抑制脂肪分化的作用，在促进成骨分化和保持骨量中具有关键作用[11]。

Hu等[12]发现miR-142-3p能够通过调节靶基因APC促进人成骨细胞(hFOB1.19)成骨分化，进一步通过转染miR-142-3p模拟物使miR-142-3p表达上调，免疫蛋白印迹分析发现β-catenin表达上调，因此 miR-142-3p通过靶向调控APC使β-catenin表达上调促进成骨细胞分化。Miclea等[13]研究表明APC基因功能缺失的转基因小鼠成骨分化和成软骨分化升高，进一步验证了上述结果。有趣的是Hu等[14]发现miR-142-3p在人胚肾细胞(HEK293)中通过靶向调控CTNNB1基因抑制Wnt信号通路，CTNNB1是一种编码β-catenin的基因。上述研究表明miR-142-3p通过调控不同靶基因既可以抑制Wnt信号通路，又可以促进Wnt信号通路而发挥不同的生物学效应。Wang等[15]发现在人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)中miR-346通过与靶基因GSK-3β的3'-非编码区(3'-UTR)结合，下调GSK-3B表达水平促进成骨分化，当敲除β-catenin后miR-346促进成骨细胞分化效应减弱。因此miR-346通过Wnt/β-catenin信号通路靶向调控GSK-3β促进成骨分化。Zhang等[16]研究发现，在人脂肪源性间充质干细胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)中miR-218通过靶向调节硬骨素(Sclerostin，SOST)促进成骨分化，SOST是Wnt信号通路的一种抑制因子，通过与Wnt信号通路LRP5/6受体结合发挥效应。Ma等[17]最近研究发现miR-96通过Wnt信号通路靶向下调SOST，使Wnt信号通路下游成骨核心转录因子Runx2表达水平升高，促进强直性脊柱炎小鼠模型BMSCs成骨分化，因此在未来miR-96可能成为治疗强直性脊柱炎的潜在靶点。

1.2 TGF-β信号通路 TGF-β超家族由超过30个生长和分化因子组成，包括TGF-βs和BMP，TGF-β信号通路参与细胞增殖、成骨细胞分化、胚胎发育等多种生命活动过程[18]。哺乳动物中有三种TGF-βs蛋白即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，研究表明TGF-β2在胚胎骨骼发育中占有重要作用，TGF-β2 功能缺陷小鼠将出现各种骨骼疾病，如骨质疏松症[19]。

Li等[20]研究发现miR-21可以通过TGF-β信号通路靶向调控SMAD7促进小鼠胚胎成骨前体细胞(MC3T3-E1)成骨分化，在成骨诱导过程中miR-21表达上调，SMAD7表达降低，敲除SMAD7可以促进MC3T3-E1细胞成骨分化及骨矿化。有趣的是Meng等[21]发现在人脐带间充质干细胞中miR-21也可以通过调控P13K/AKT信号通路促进成骨细胞分化，进一步通过实验和生物学信息分析证实PTEN为miR-21调控P13/AKT信号通路的靶基因，当PTEN功能受到抑制时下游的Runx2和β-catenin活性升高促进成骨分化。Mei等[22]研究还发现miR-21还可以通过ERK/MAPK信号通路促进成骨细胞分化。上述研究证实miR-21可以通过不同的靶基因调控不同的信号通路发挥生物学效应。Bhushan等[23]研究表明在MC3T3-E1细胞成骨诱导分化过程中miR-181a上调，过表达miR-181a后发现早期成骨标志物碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性升高，茜素红染色后钙盐结节增多。进一步通过生物学信息分析和荧光素酶实验证实Rgs4和Gata6为miR-181a靶基因，miR-181a通过靶向调控Rgs4和Gata6在TGF-β信号通路中促进成骨分化。Bai等[24]最近研究发现在股骨头坏死小鼠模型血清中miR-27a表达下调，miR-27a模拟物转染MC3T3-E1细胞后，不仅Runx2、骨钙素表达上调，ALP活性增强，而且TGF-β及Smad7蛋白表达升高。通过质粒转染TGF-β或Smad后，miR-27a对MC3T3-E1细胞的成骨分化效应增强，进一步证实miR-27a通过TGF-β信号通路促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，因此通过miR-27a调控TGF-β信号通路可能成为未来治疗股骨头坏死的潜在靶点。

1.3 BMP信号通路 BMPs是TGF-β超家族中的一员，在调控成骨分化和骨生成中具有重要意义[25]。BMP信号通路也有经典的信号通路和非经典的信号通路，经典的信号通路依赖于Smad，BMPs通过与骨形态发生蛋白受体Ⅰ和骨形态发生蛋白受体Ⅱ结合激活BMP信号通路[26]。哺乳动物中有14种BMPs，其中BMPs2，4，5，6，7，9在调控MSCs成骨分化过程中具有重要意义，Runx2是BMP信号通路的下游靶点，BMP2和BMP7在成骨分化过程中均上调Runx2的表达[25]。

在成骨分化过程中，miRNA参与BMP信号通路中关键因子的表达。Liu等[27]研究发现在对小鼠BMSCs成骨诱导过程中miR-155下调，过表达miR-155后，ALP活性下降，与成骨有关基因Runx2、Osterix(OSX)、骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨桥素(osteopontin，OPN)表达下降，进一步研究证实BMP9为miR-155靶基因，miR-155通过靶向调控BMP9抑制BMP信号通路而抑制成骨分化。Kim等[28]研究表明miR-196a参与调控hASCs的增殖及成骨分化过程，当miR-196a与靶基因HOXC8的3'UTR结合后抑制HADSCs增殖而促进成骨分化，HOXC8可抑制BMP-2表达，因此当miR-196a与HOXC8结合后，HOXC8下调而BMP-2上调，miR-196a通过BMP信号通路促进成骨分化。Zhang等[29]发现在hASCs及hMSCs成骨诱导过程中，miR-20a表达上调，进一步研究证实Bambi、Crim1和PPARγ是miR-20a的直接靶点，Bambi和Crim1是BMP信号通路的表面抑制因子，PPARγ是促进成脂分化的重要因子，激活的PPARγ可导致Runx2表达下降，miR-20a抑制靶基因Bambi、Crim1和PPARγ的表达通过BMP信号通路促进成骨分化。Cui等[30]研究发现敲除miR-185(KO)小鼠6周后，与野生型小鼠相比，KO小鼠的骨体积增加，荧光素实验证实Bgn是miR-185的直接靶点，Bgn可以通过BMP/Smad信号通路促进成骨分化，miR-185靶向调节Bgn抑制BMP/Smad信号通路抑制成骨分化。

1.4 NOTCH信号通路 Notch信号通路由Notch配体、Notch受体(DSL蛋白)及细胞内效应器分子(CSL-DNA结合蛋白)组成[31]。Notch信号通路参与细胞间信息传递，调控各种细胞的分化过程，在抑制BMSCs成脂肪分化过程中具有重要意义[32]。研究表明，阻断Notch信号通路可通过PTEN-P13K/AKT/mTOR信号通路促进BMSCs自噬介导的脂肪分化[33]。除了对脂肪分化抑制作用外，Notch信号通路还可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制成骨分化[34]。然而，也有研究表明Notch信号通路可以通过调节BMP2的表达促进成骨分化[35]。因此，Notch信号通路可通过直接靶向相关基因或与其他信号通路相互作用，以复杂的方式调控MSCs的成骨和成脂分化过程。

Gamez等[36]研究发现在乳头干细胞中Notch信号通路的激活抑制细胞分化，miR-34a过表达可促进成骨分化，进一步研究证明Notch2和HES1为miR-34a靶基因，miR-34a与Notch2、HES1的3'UTR区结合促进Runx2、OSX及OCN的表达。以上结果表明miR-34a通过靶向调节Notch2和HES1通过Notch信号通路促进成骨分化。Yang等[37]发现过表达miR-10a会促进hBMSCs成骨分化，转染miR-34a模拟物后miR-34a与KLF4的3'UTR区结合抑制荧光素酶活性，miR-34a抑制靶基因KLF4表达促进hBMSCs成骨分化。Qu等[38]发现在黄韧带骨化患者中黄韧带细胞miR-199b-5p表达下降，进一步实验证明JAG1是miR-199b-5p的靶基因，miR-199b-5p靶向调节JAG1通过Notch信号通路抑制成骨分化。

综上所述，以上四种信号通路在调控BMSCs分化过程中发挥重要作用，此外与BMSCs分化相关的信号通路还有MAPK、ICF1/ET1、FAK、Hedgehog等信号通路。miRNA与多个信号通路及转录因子形成复杂的调控网络，不同信号通路之间相互作用，调控着BMSCs的成骨分化。

2 结 语

随着人口老龄化的加剧，OP已经成为一个重要的健康问题。OP患者骨髓间充质干细胞成骨能力减弱、成脂能力增强是导致骨质疏松症的原因之一，已发现大量miRNA参与转录因子或信号通路的调控，影响着BMSCs的成骨分化过程，这些信号通路及转录因子涉及复杂的调控网络。目前对OP的治疗主要以双磷酸盐等骨吸收抑制剂为主[39]，但药物副反应大，患者依从性差，治疗效果不理想。BMSCs因具有多能性已经成为细胞治疗OP的热点，因此改变BMSCs分化的方向，即促进成骨细胞分化抑制脂肪细胞分化成为潜在治疗骨折疏松症的策略。深入了解miRNA调控BMSCs分化分子机制可以进一步明确骨质疏松的病因，为寻求新的分子诊断标志物及靶向治疗骨质疏松症提供理论依据。