滨海白首乌黄酮超声辅助提取工艺优化

孙 倩,冯 进,李春阳*, Chuon Mony Roth, Sun Sovath, Taing Bunhok

(1.南京理工大学 化工学院,江苏 南京 210094;2.江苏省农业科学院 农产品加工研究所,江苏 南京 210014;3.柬埔寨农业渔业部农产品和食品实验室,金边 10103)

滨海白首乌又称白人参,它不仅是滨海有名的传统特产,还是中国传统的“药食同源”食材、中药材。现代药理活性研究表明:白首乌具有抗肿瘤、抗衰老、抗缺氧、降血脂、调节免疫功能等生物活性[1-3]。目前,从白首乌中分离得到的化学成分有C21甾苷、磷酯类、黄酮类、多糖、氨基酸以及维生素等[4-5]。黄酮类化合物是由植物在光合作用下产生的一大类化合物,其一般具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血脂、调节免疫功能等作用[6-8]。超声波辅助提取技术是一种有效的分离技术,它主要是采用超声波的空化作用,即当一定频率的超声波开始作用于溶液时,液体中大小适宜的小气泡会发生共振现象,强有烈的冲击波会使细胞壁破裂,其中的有效物质溶出,并且整个体系不会因温度大幅升高而破坏掉其中的有效成分,能强化浸提效率,而且高效、节能、省时,因而具有极高的应用价值[9-10]。此方法在天然产物浸提方面得到了越来越多的应用。本实验通过单因素和正交试验优化了滨海白首乌黄酮的提取工艺,以期为进一步研究和开发白首乌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

滨海白首乌粉末，由盐城果老首乌科技有限公司提供;芦丁对照品，由国药集团化学试剂有限公司提供;无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝,均为分析纯;试验用水为二次去离子水。

BS210S型电子天平，为北京Sartorious公司的产品; UV1700PC紫外可见分光光度计，为上海奥析科学仪器有限公司产品; KQ-100DB超声波清洗仪，为昆山舒美超声仪器有限公司产品; SHZ-D型循环水真空泵，为巩义市瑞德仪器设备有限公司产品; DHQ-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，由上海精宏实验设备有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制[11]准确称取10.6 mg的芦丁标准品于烧杯中,用80%的乙醇溶液溶解后定容于50 mL的容量瓶中,摇匀,得到浓度为0.212 mg/mL的芦丁对照品溶液。分别精密移取对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL比色管中,再分别加入80%乙醇溶液至总体积3 mL;再加5%亚硝酸钠0.4 mL，混匀;放置6 min后加入10%硝酸铝0.4 mL，混匀;放置6 min后再加入4%氢氧化钠4 mL,均用蒸馏水定容至10 mL,充分混匀,放置15 min。以第1管作为空白,于510 nm波长处测定其吸光度,以吸光度值对应芦丁浓度绘制标准曲线。

1.2.2 精密度试验 准确移取0.212 mg/mL的芦丁对照品溶液3.0 mL,按1.2.1中的方法平行测定吸光度值5次,计算其吸光度的相对标准偏差(RSD)。

1.2.3 重复性试验 准确移取5份0.212 mg/mL的芦丁对照品溶液1.0 mL,依次按1.2.1中的方法测定吸光度值,计算其吸光度的RSD值。

1.2.4 加标回收率试验 准确移取5份0.12 mg/mL的白首乌黄酮提取液1.0 mL,分别精确加入0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg芦丁对照品,按1.2.1中的方法测定吸光度值,计算回收率。回收率=(加标样品含量-样品含量)/加标量×100。

1.2.5 白首乌总黄酮的提取工艺 准确称取白首乌块根的干燥粉末0.50 g于50 mL具塞锥形瓶中,按要求加入一定量的乙醇溶液,利用超声波法协同有机溶剂辅助提取工艺,在一定温度、一定功率下超声提取一定时间,抽滤,将得到的提取液定容于25 mL的容量瓶中，待测。

1.2.6 单因素试验设计[12]

1.2.6.1 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响 准确称取一定质量的白首乌粉末，置于具塞锥形瓶中,按液料比20∶1向其中加入体积分数分别为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇,在超声时间为25 min、超声温度为50 ℃、超声功率为400 W的条件下提取,抽滤定容得到提取液；移取1 mL提取液，按1.2.1中的方法测定其吸光度,计算总黄酮提取量；做3次平行试验,探究乙醇浓度对总黄酮提取量的影响。

1.2.6.2 液料比对总黄酮提取量的影响 准确称取一定质量的白首乌粉末，置于具塞锥形瓶中,按液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1分别向其中加入体积分数为80%的乙醇,在超声时间25 min、超声温度50 ℃、超声功率400 W的条件下提取；其余操作同1.2.6.1中的操作,探究液料比对总黄酮提取量的影响。

1.2.6.3 超声时间对总黄酮提取量的影响 准确称取一定质量的白首乌粉末,按液料比30∶1向其中加入体积分数为80%的乙醇,在超声时间分别为10、20、30、40、50 min,超声温度50 ℃,超声功率400 W的条件下提取；其余操作同1.2.6.1中的操作,探究超声时间对总黄酮提取量的影响。

1.2.6.4 超声温度对总黄酮提取量的影响 准确称取一定质量的白首乌粉末,按液料比30∶1向其中加入体积分数为80%的乙醇,在超声时间20 min,超声温度分别为30、40、50、60、70 ℃,超声功率400 W的条件下提取；其余操作同1.2.6.1中的操作,探究超声温度对总黄酮提取量的影响。

1.2.6.5 超声功率对总黄酮提取量的影响 准确称取一定质量的白首乌粉末,按液料比30∶1向其中加入体积分数为80%的乙醇,在超声时间20 min,超声温度40 ℃,超声功率分别为240、280、320、360、400 W的条件下提取；其余操作同1.2.6.1中的操作,探究超声功率对总黄酮提取量的影响。

1.2.7 正交实验设计 在单因素实验结果的基础上,选取其中的乙醇浓度(A)、液料比(B)、超声时间(C)和超声温度(D)4个主要因素为考察因素,在4个因素里面分别选择对白首乌总黄酮提取量影响较大的3个水平,选用L9(34)正交表设计正交实验,以滨海白首乌中的总黄酮提取量为考察指标,每次实验重复3次,确定最佳的提取工艺组合。

1.2.8 白首乌中黄酮含量的测定方法 移取1 mL提取液置于10 mL比色管中,按1.2.1中的方法测定其吸光度,由回归方程可得到总黄酮含量,再根据下式计算出总黄酮提取量。

y=(cV1V3)/(V2W)

上式中：y为总黄酮提取量(mg/g);c为移取液的黄酮浓度(mg/mL);V1为移取液的定容体积(mL);V2为移取液的体积(mL);V3为药材提取液的定容体积(mL);W为药材质量(g)。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2016、Origin 8.0、SPSS Statistics 23进行数据处理及分析。所有试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以吸光度值(A)为纵坐标,以芦丁溶液浓度(c)为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程A=10.883c-0.0076,R2=0.9989;结果表明,当芦丁浓度在0.01～0.06 mg/mL范围内时,其与吸光度呈现良好的线性关系。

2.2 精密度试验结果

5次测定的吸光度值分别为0.692、0.687、0.691、0.678、0.689，计算得到其相对标准偏差(RSD)为0.81%,表明本试验结果的精密度良好。

2.3 重复性试验结果

5次测定的吸光度值分别为0.217、0.225、0.219、0.223、0.220，计算得到其RSD为1.45%,表明本试验的重复性良好。

2.4 加标回收率试验结果

试验结果(表1)表明：平均回收率为99.2%, RSD为1.57%,证明该方法准确性高。

表1 加标回收率试验结果

2.5 单因素试验结果

2.5.1 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响 由图1可知,伴随乙醇浓度的增加,白首乌总黄酮提取量先逐渐增大;当乙醇浓度为80%时,提取量最高,达到2.37 mg/g；此后继续增大乙醇浓度,提取量下降。这可能是因为当乙醇浓度较低时,黄酮类化合物还未充分溶解,而当乙醇浓度过高时,溶剂极性降低,脂溶性等杂质溶出,与黄酮类化合物竞争同种溶剂[13-15],导致总黄酮提取量降低。故确定最佳乙醇浓度为80%。

图1 乙醇浓度对总黄酮提取量的影响

2.5.2 液料比对总黄酮提取量的影响 由图2可知,随着液料比升高,总黄酮提取量先升高；在液料比为30∶1时提取量最高,达到3.02 mg/g；但继续增加液料比时提取量下降。这可能是因为溶剂用量较少时,与物料接触不充分,黄酮类化合物提取不完全,而当溶剂用量过多时,会导致除黄酮之外的其他杂质溶出[13,16]。故确定最佳液料比为30∶1。

图2 液料比对总黄酮提取量的影响

2.5.3 超声时间对总黄酮提取量的影响 从图3可以看出：当超声时间在20～50 min内增加时,总黄酮提取量呈降低趋势；而当超声时间在10～20 min范围内增加时,提取量呈增大趋势。这可能是因为在一定的时间内,超声波有利于增加白首乌中黄酮类化合物的溶出,但当提取时间较长时,温度较高,溶剂挥发,部分黄酮可能会被氧化,黄酮类化合物分子结构遭到破坏,使得提取量降低[9,17]。故确定最佳超声时间为20 min。

图3 超声时间对总黄酮提取量的影响

2.5.4 超声温度对总黄酮提取量的影响 由图4可见：当超声温度在30～40 ℃范围内升高时,总黄酮提取量呈增大趋势；随着超声温度在40～50 ℃范围内逐渐升高,总黄酮提取量呈下降趋势；随着超声温度在50～70 ℃范围内升高,总黄酮提取量变化不大。这可能是因为当超声温度低时,超声波频率较小,溶质还未充分接触溶剂,提取量低；当温度过高时,部分黄酮类物质可能被氧化或分解,并且加速其他杂质的溶出，致使提取量降低[18]。同时可以看出超声提取法的最佳温度远低于水浴提取法的最佳温度[19]。因此,确定最佳超声温度为40 ℃。

图4 超声温度对总黄酮提取量的影响

2.5.5 超声功率对总黄酮提取量的影响 由图5可知：在240～280 W的超声功率范围内,总黄酮提取量呈增大趋势；随着超声功率在280～400 W范围内逐渐升高,总黄酮提取量呈现下降趋势。这可能是因为增大超声波功率会加强细胞的破碎力度,从而使得黄酮溶出量加大；但是过度增加超声波功率,不仅会增加能耗,而且因其强烈的空化作用会破坏有效成分,导致提取量降低[20-21]。因此,最佳超声功率为280 W。

图5 超声功率对总黄酮提取量的影响

2.6 正交试验结果

正交试验各因素的水平如表2所示,结果如表3所示。

表2 正交试验各因素的水平

由表3可知,各个因素水平对总黄酮提取量有不同的影响,由极差分析结果可知,4个因素对提取量的影响大小为A>B>C>D,确定的最佳提取工艺条件是A3B1C3D2；在此组合条件下,进行3次验证试验,总黄酮平均提取量为3.95 mg/g，高于邹艳敏[22]用回流法和微波法提取的白首乌黄酮量(3.53 mg/g)。与张锋等[19]用水浴回流提取法提取的白首乌黄酮量(2.8544 mg/g)相比,本试验提取的总黄酮量不仅大幅增加,而且使用超声波辅助法提取白首乌黄酮操作方便,提取时间(3 h)也大大减少。

表3 正交试验方案和结果

由表4可知：在采用超声辅助法提取白首乌总黄酮的工艺中,A因素(F0.1

表4 正交试验方差分析结果

3 小结与讨论

本实验以滨海白首乌为研究对象,以总黄酮为目标化合物,对超声波辅助提取滨海白首乌总黄酮的工艺进行了系统地探究,得到的最佳提取工艺为:乙醇浓度90%、超声时间30 min、液料比20∶1,超声温度40 ℃。在此最佳条件下,白首乌中总黄酮提取量为3.95 mg/g。对超声波辅助法提取有影响的因素较多,鉴于此,我们对白首乌总黄酮提取的其他影响因素还需进一步探究。本研究结果为进一步探讨白首乌黄酮等成分的提取提供了参考依据。