Epstein-Barr病毒DNA在鼻咽癌临床应用中的进展

钟方炎，赖军明，顾伟国，邓剑雄，罗 辉，林 红

(1.南昌大学第一附属医院肿瘤科，南昌330006; 2.义乌市中心医院放射治疗中心，浙江 义乌322000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种起源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，在世界范围内的分布具有明显的种族和地域的差异，是我国华南地区常见的恶性肿瘤，每年的发病率为3/10万[1]。目前其治疗方式是以放疗为主，再根据不同的临床TNM分期结合化疗。作为常规的分期手段，TNM分期指导着临床治疗并提示NPC的预后，但相同TNM分期的患者接受了同样的治疗方案，其疗效也有很大的差异。随着对NPC发生发展相关机制研究的不断深入，研究者[2-3]认识到单独TNM分期可能不足以准确详细地指导NPC的治疗及进行预后判断，因此提出使用生物学标志物或许可以作为临床分期的补充，从而更好地指导治疗并判断预后，其中EB病毒DNA(Epstein-Barr virus DNA，EBV-DNA)作为一种与NPC关系密切的生物学标记物已在相关研究中体现出其卓越的特异性和敏感度，并受到临床工作者的认可。本文拟对EBV-DNA及EBV-DNA在鼻咽癌临床应用中的进展作一综述。

1 EBV-DNA是重要的生物学标志物

根据相关临床资料[4-10]分析，NPC的预后因素可能包括性别、年龄、放化疗方式、C-反应蛋白、血常规相关指标(白细胞计数、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、血红蛋白水平、血小板计数、红细胞计数、血小板/淋巴细胞比率、中性粒细胞/淋巴细胞比率、淋巴细胞/单核细胞比率)、乳酸脱氢酶水平、白蛋白水平、体重指数、TNM分期。但上述指标仅反应了患者的营养状况、免疫功能，具有普适性，与NPC之间的关联程度有待考量，不具有很强的特异性。

EBV是疱疹病毒家族的一员，它已经被证实是多种疾病的病因，在NPC流行地区(病理类型以未分化型非角化癌为主)，患者均含有EBV基因组[11-12]。克隆EBV基因组存在于早期侵袭性病变或原位癌中，表明在恶性侵袭性肿瘤发展之前已有EBV感染[13]。目前认为EBV潜伏感染NPC细胞，并散在地产生病毒性裂解感染，EBV基因的表达仅限于EBNA1、LMP1、LMP2、EBERs和BART编码的miRNA，而在这些基因中，LMP1是由EBV编码的主要癌蛋白，其可以促进肿瘤的发生发展，促进细胞运动、侵袭和转移，促进淋巴管生成，促进遗传和表观遗传的改变[3]。EBV-DNA从肿瘤组织中脱落到血浆中,因此临床上常检测血浆EBV-DNA(pEBV-DNA)水平值来判定体内EBV的程度[14]。治疗前和治疗后持续高水平的pEBV-DNA与晚期疾病、肿瘤负荷、疾病复发和预后差有关[15-17]。NPC治疗后血浆EBV特异性抗体水平下降或恒定提示预后较好，滴度的增加则强烈提示着预后不良[18]。在放疗或NPC切除术中进行的动力学检测表明，大多数患者在治疗过程中可较早和迅速地清除EBV-DNA，随后的任何增加都可能提示亚临床疾病复发[19-20]。由于EBV-DNA在NPC中广泛存在、与NPC发生发展密切相关，具有较强特异性和敏感性，可以提示NPC患者的预后并且方便易测，现已在临床中广泛应用。

2 EBV-DNA可作为无症状早期NPC患者筛查的工具

由于NPC的预后与肿瘤的临床分期有很大关系，局限病灶的患者5年总体生存率(Overall survival,OS)可达到90%，但发生转移的患者5年OS则低于50%[21]。而超过75%的患者在疾病发现时已经为局部晚期或者发生了转移[21-22]。因此，通过筛查手段发现无症状的NPC患者将改善这种状况。在CHAN等[23]的一项研究中，招募了1318名志愿者，并对他们进行EBV-DNA和病毒衣壳抗原IgA血清学监测，对持续阳性的患者重复监测并行鼻咽镜及磁共振检查，最后明确3名志愿者患有早期NPC。另一项约有20 174名接受EBV-DNA筛查的研究[24]中，1112名参与者可测得EBV-DNA，其中309名在重新检测的样品上测得有持续的阳性结果，并对其中的大部分参与者进行内镜检查和(或)磁共振检查，最后确认34名参与者患有NPC；且通过筛查确定患有NPC的参与者中Ⅰ期或Ⅱ期疾病的比例明显高于历史队列(71%比20%，P<0.001)。这提示EBV-DNA筛查作为一种无创的手段可使无症状早期NPC患者检出率提升，有助于提升NPC患者的OS。但由于在其他疾病中也可检测到EBV-DNA，这些疾病包括传染性单核细胞增多症、霍奇金病等[25-26]，所以在筛查NPC时也要注意患有这些疾病的可能。

3 EBV-DNA可监测治疗后残余疾病并提示疾病复发

TO等[19]研究发现，在进行手术切除肿瘤后，pEBV-DNA从血液循环中被迅速清除，平均半衰期只有139 min。CHAN等[27]的研究结果证实，循环中EBV-DNA多为200 bp以下的短片段，可以被人体降解，而肿瘤衍生的EBV-DNA正是裸DNA片段，并未与病毒颗粒结合，提示可测得的EBV-DNA是由肿瘤所产生。LO等[20]探索放疗后pEBV-DNA的清除率，他们发现放疗后患者的pEBV-DNA水平会立即出现激增，而这种快速的激增是由于死亡的NPC细胞中EBV-DNA的快速释放，并且激增过后，pEBV-DNA水平降低，中位半衰期为3.8 d。因此，治疗后因为肿瘤负荷的减少和人体正常的降解能力，EBV-DNA水平可以快速降低。而pEBV-DNA的下降率也被证明具有预后价值,与pEBV-DNA水平下降较慢的患者相比，下降较快的患者生存率更高[28-30]。由于EBV-DNA直接来源于NPC细胞，通过治疗成功清除所有肿瘤细胞，有望彻底清除循环中的EBV-DNA。另一方面，经治疗后，EBV-DNA在血浆中持续存在，提示体内存在残余的肿瘤细胞。之后的一项研究[31]证实，治疗后EBV-DNA水平对OS和无病生存率具有很强的预测作用,与较低及未检测出EBV-DNA水平的患者相比,治疗后EBV-DNA水平>500 copies·mL-1患者NPC复发的相对风险为11.9。这些结果通过对不同种族和临床分期的患者的其他研究也得到了证实[32-34]。而一旦疾病复发或者转移之后，5年的生存率将显著下降。LEUNG等[30]进一步证明，与未检测到EBV-DNA的患者相比，单纯放疗或同步放化疗在整个过程的中位时间点可检测到的pEBV-DNA水平与随后的远处转移、OS和无病生存相关。通过pEBV-DNA水平分析识别出有残余肿瘤或高复发风险的患者，并通过强化化疗或其他治疗来提升这些患者的OS，而pEBV-DNA检测不出的患者则可减少不必要治疗，避免治疗相关的毒副作用，减少经济负担。

4 EBV-DNA结合TNM建立新分期模型指导临床治疗

一项针对NPC患者(n=57)血浆EBV-DNA定量研究结果显示，pEBV-DNA水平在较晚分期(Ⅲ+Ⅳ期)比较早分期(Ⅰ+Ⅱ期)高4～10倍[14]。而后MA等[35]利用鼻咽磁共振成像发现血浆EBV-DNA水平与NPC肿瘤体积呈正相关。CHAN等[36]利用小鼠模型探索了NPC肿瘤负荷与血浆EBV-DNA水平的之间的关系，证明了人NPC异种移植的裸鼠pEBV-DNA水平与肿瘤质量呈线性关系。由于肿瘤负荷与血浆EBV-DNA的水平直接相关，因此EBV-DNA可用来推断NPC患者的预后并指导治疗。随后有研究[22,32,37]进一步证明，与临床分期相比，pEBV-DNA在预测患者总体生存期方面具有更强的预后价值。这些均提示将EBV-DNA分析纳入NPC分期系统，建立新的分期模型可能能更好地判断预后和指导临床治疗，而如何将两者相结合形成新的分期模型已经受到众多研究者关注。LEUNG等[22]尝试将治疗前pEBV-DNA水平与TNM分期相结合，制定新的分期模式用于评估治疗前非转移性NPC的预后。pEBV-DNA水平高低以4000 copies·mL-1为界，分成4组：第1组(Ⅰ+Ⅱ，低pEBV-DNA水平)、第2组(Ⅰ+Ⅱ，高pEBV-DNA水平)、第3组(Ⅲ+Ⅳ，低pEBV-DNA水平)、第4组(Ⅲ+Ⅳ，高pEBV-DNA水平)。4组患者的5年OS分别为91%、64%、66%、54%。

而后，ZHANG等[38]的一项回顾性研究结果显示，治疗前pEBV-DNA水平高低以4000 copies·mL-1为界，结果发现Ⅱ—Ⅲ期低pEBV-DNA水平患者与Ⅳa-b期(AJCC第7版)低pEBV-DNA水平患者5年OS分别为94.7%、92.9%(P=0.141)，Ⅱ—Ⅲ期高pEBV-DNA水平患者与Ⅳa-b期低pEBV-DNA水平患者5年OS为82.7%、92.9%(P=0.025)，Ⅱ—Ⅲ期高pEBV-DNA水平患者与Ⅳa-b期高pEBV-DNA水平患者5年OS为82.7%、71.7%(P=0.001)，因此研究者将患者分成4组：1)极低风险组：Ⅰ期，无论pEBV-DNA水平；2)低风险组：Ⅱ—Ⅳa-b期，低pEBV-DNA水平；3)中度风险组：Ⅱ—Ⅲ期，高pEBV-DNA水平；4)高风险组：Ⅳa-b期，高pEBV-DNA水平。

在2019年的ESMO ASIA会议上，CHAN等[39]进行的“鼻咽癌0502研究”中，根据数据建立新风险分组并进行验证，将治疗后pEBV-DNA水平分成4组，分别为0 copies·mL-1、1～49 copies·mL-1、50～499 copies、≥500 copies·mL-1，然后通过递归分割分析分3组：低危组(0 copies·mL-1和Ⅱ期/Ⅲ期，1～49 copies·mL-1和Ⅱ期)、中危组(0 copies·mL-1和ⅣAB期，1～49 copies·mL-1和Ⅲ/ⅣAB期)、高危组(50～499 copies·mL-1和Ⅱ期;高危组为50～499 copies·mL-1和Ⅲ/ⅣAB期，≥500 copies·mL-1和任何期)。并对单一TNM分期、单一pEBV-DNA水平和新风险分组进行一致性指数比较，数值分别为0.604、0.675、0.712，提示新风险分组准确度在3组中最高。

5 结语与展望

EBV-DNA的应用可使未来无症状及治疗效果不佳的NPC患者较早被发现，并且使治疗过程更加精准化。目前不同实验室的EBV-DNA检测技术水平差别很大，希望未来在实验室设备，试剂材料，以及样品收集、处理、结果报告等方面形成一套规范化体系。随着EBV-DNA检测技术精度提升和价格下降，或许其有望成为NPC早期筛查的常规手段。治疗结束后患者复查主要依靠磁共振，而磁共振检查在放疗结束的早期由于炎症、瘢痕等原因会产生假阴性结果，而未来EBV-DNA可以作为影像学检查的补充，发现那些有残余疾病或高危复发患者。未来根据新分期模型，风险较低患者可能可以减少后续不必要的治疗，这将使得极大一部分患者能够减轻经济负担，免受辅助化疗或其他治疗可能带来的毒副反应，提高生活质量。并且明确风险较高的患者则需要辅助化疗或者接受新的治疗手段，以此来减少微转移灶，降低复发率，提高生存率。