不同正畸力值对哺乳期大鼠正畸牙周组织中HO-1 CC类趋化因子受体1及其配体的影响

焉宏军 王荣强 张雯姝

正畸即对错牙合畸形进行纠正，牙合畸形患者可通过正畸达到美容效果[1]。抗缺氧、抗炎蛋白血红素氧合酶(Heme Oxygenase-1，HO-1)是组织内有效的抗氧化剂。HO-1可能在牙髓血流调控、牙本质形成及牙髓细胞代谢和分化中起调控作用[2-3]。CC趋化因子受体1(CC-chemokine receptor 1，CCR1)及其相关配体表达与正畸牙移动过程及牙周骨改建相关[4]。抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)是破骨细胞的特征酶，其表达和分泌与破骨细胞功能密切相关，TRAP阳性细胞的位置和水平与乳牙生理性的根吸收进程密切相关[5]。有研究[6]显示，哺乳期患者正畸牙移动速率较非哺乳者加快。为提高哺乳期正畸患者的正畸效果，本文制备哺乳期大鼠模型，拟探讨不同正畸力值对大鼠牙周组织中HO-1、CC类趋化因子受体1及其配体的影响，以期为临床哺乳期正畸患者制定最佳正畸治疗方案提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择3月龄Wistar大鼠126只(均购自辽宁大连实验动物公共服务平台-实验动物中心)，其中雌性96只，雄性30只，SPF级，平均体质量(200±20)g，分笼饲养，定时给予磨碎的固体饲料，饮消毒清水，每12 h间隔照明，控制室温18～23°C、湿度在56%、室内噪音60 dB以下，同时定期进行紫外线消毒及通风，适应性饲养一周后开始实验。整个实验期间记录每只大鼠的状态。

1.2 主要仪器及试剂 0.20 mm结扎丝(杭州晨阳正畸材料厂)，0.012 inch×9 mm镍钛螺旋弹簧(北京圣玛特科技有限公司)，光固化树脂和树脂粘结剂(美国MEDENTAL国际齿科机关)，杆式测力计(杭州奥杰医疗器械有限公司)，微型牙科技工打磨机(韩国世新精密株式会社)，双能X线骨测量密度仪(美国Hologic公司)，高温高压真空消毒炉(苏州顺美口腔医疗设备有限公司)，Cobas e601免疫分析仪(德国罗氏诊断公司)，兔抗大鼠HO-1多克隆抗体(美国CST公司，货号：86806)，FastPrep仪(美国MP医疗器械贸易有限公司)，7500Fast实时荧光定量PCR仪(美国Life technologies公司)。

1.3 方法

1.3.1 哺乳期大鼠模型制备 采用阴道涂片法确定大鼠的动情周期，将大鼠呈卧位固定后用20 μL生理盐水对阴道进行灌注，在反复吹打3～4次后滴至载玻片上，在40倍镜下观察，从而确定大鼠的动情周期。在大鼠动情前期，按照雌雄1∶1的比例合笼，清晨制备涂片镜下检查发现孕栓后，即确定雌鼠为妊娠状态。之后进行单笼饲养，大鼠自然分娩后通过母乳喂养仔鼠，喂养4周后断奶，此时认定哺乳期模型鼠制备成功。共成功制备72只哺乳期模型大鼠。

1.3.2 不同正畸力值干预 将此72只大鼠按随机数字表法分为0N组、0.29N组、0.49N组和0.98N组，每组18只。根据分组依次给予0 N、0.29 N、0.49 N及0.98 N正畸力。具体操作：分别对各组大鼠进行全身麻醉，麻醉剂为3.3 mL/kg的水合氯醛，之后用开口器将大鼠口腔撑开，采用尖头的金刚砂车针在右上第一磨牙近牙颈部颊舌面进行打磨，直至磨出0.5 mm槽沟，再穿一根结扎丝经过第一、二磨牙临近点的下降，结扎、固定第一磨牙，一端连接镍钛螺旋弹簧，在大鼠的切牙亚冠颊舌面、远中面磨出一0.5 mm槽沟，之后将结扎丝嵌入沟内，连接2个中切牙为一个整体，连接螺旋弹簧的另一端，之后清洁、隔湿中切牙，牙面涂抹上釉质酸蚀剂，之后停留30 s再冲洗吹干，再涂抹树脂粘结剂，光固化树脂封闭、固定切牙牙颈部，以防结扎丝松动、脱落，增强支抗。采用测力计测量NiTi弹簧拉伸的力量，确保各组大鼠符合所设定的正畸力值。每日检查一次加力装置是否完整，如有脱落、损坏情况，及时修理、安装。

1.4 观察指标 比较给予不同正畸力值的4组大鼠在干预前1天及干预第1、3、7天后的CCR1及其配体(CCL3、CCL5)mRNA相对表达量，HO-1水平及TRAP破骨细胞染色水平。

1.4.1 CCR1及CCL3、CCL5 mRNA检测 每个组选取6只大鼠麻醉后用Rnase-free溶液对心脏进行灌注，之后将第一磨牙拔除，取下牙周膜及牙槽骨，将其置入1.5 mL Rnase-free离心管中，再加入1 mL Trizol试剂，分别用FastPrep仪将组织磨碎、匀浆后用Fastprep程序对总RNA进行提取。采用7500 Fast实时荧光定量PCR仪行逆转录，合成cDNA，由上海立菲生物技术有限公司合成引物，之后每个基因做3个复管，对目的基因及β-actin用SYBR绿色荧光定量系统性实时荧光定量PCT扩增，条件为95°C下2 min，之后以95°C下10 s、60°C下30 s、70°C下30 s各行40个循环。计算各指标相对表达量。

1.4.2 牙周组织中HO-1水平的检测 在每组剩余的12只大鼠中选取6只，采用SP法检测HO-1水平：牙周组织处理方法同上，兔抗大鼠多克隆HO-1抗体稀释浓度为1∶100，生物素山羊抗兔IgG(美国CST公司，货号：7054)作为二抗(稀释度1∶100)，之后行组织切片，常规脱蜡入水后用微波加热法对抗原进行修复，DAB进行显色，苏木素复染，之后进行封片，阴性对照用磷酸缓冲盐代替一抗，其他条件相同，阳性表达为细胞胞浆呈棕黄色颗粒状改变。每张取5个400×高倍视野，表达强度呈色用平均吸光度(optical density，OD)表示。

1.4.3 TRAP破骨细胞染色 将各组剩余的6只大鼠，静脉采血，离心取血清，使用人骨纯化的破骨细胞兔抗大鼠TRAP/CD40单克隆抗体(美国CST公司，货号：15094)，通过抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0332)测定TRAP表达，具体步骤按照说明书进行操作。取大鼠第一磨牙压力侧牙牙周膜的近牙骨质侧牙周组织，在光镜下观察压力侧牙周组织的形态学变化，，并在400倍物镜下通过OBI200高清晰度彩色病理分析系定量分析TRAP阳性破骨细胞阳性面积。

2 结果

2.1 不同时间点4组大鼠CCR1 mRNA表达量比较 不同时间点4组大鼠CCR1 mRNA表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。干预前1天，各组CCR1mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)；干预第1、3天，0.29N组、0.49N组及0.98N组CCR1 mRNA表达量较0N组均增加(P<0.05)，0.49N组及0.98N组CCR1 mRNA表达量较0.29N组均增加(P<0.05)，但0.49N组和0.98N组CCR1 mRNA表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)；干预第7天，0.29N组、0.49N组及0.98N组CCR1 mRNA表达量较0N组均增加(P<0.05)，但该3组之间比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 不同时间点4组大鼠CCR3 mRNA表达量比较 不同时间点4组大鼠CCR3 mRNA表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。干预前1天，各组CCR3 mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)；干预第1、3天，0.29N组、0.49N组及0.98N组CCR3 mRNA表达量较0N组均增加(P<0.05)；0.49N组和0.98N组的CCR3 mRNA表达量较0.29N组均增加(P<0.05)，但0.49N组及0.98N组该指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)；干预第7天，0.29N组、0.49N组及0.98N组CCR3 mRNA表达量较0N组均增加(P<0.05)，与0.29N组比较，0.98N组CCR3 mRNA表达量增加(P<0.05)，而0.49N组和0.98N组CCR3 mRNA表达量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同时间点4组大鼠CCR3mRNA表达量比较

2.3 不同时间点4组大鼠CCL5 mRNA表达量比较 不同时间点4组大鼠CCL5 mRNA表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。干预前1天，各组CCL5 mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)；干预第1～7 天，0.29N组、0.49N组及0.98N组CCL5 mRNA表达量较0N组均增加(P<0.05)；0.49N组和0.98N组CCL5 mRNA表达量较0.29N组均增加，而0.49N组和0.98N组该指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同时间点4组大鼠CCL5mRNA表达量比较

2.4 不同时间点4组大鼠牙周组织中HO-1的OD值比较 不同时间点4组大鼠牙周组织中HO-1的OD值比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。干预前1天，4组大鼠牙周组织中HO-1 的OD值差异无统计学意义(P>0.05)；干预第1天，0.29N组、0.49N组及0.98N组HO-1 的OD值较0N组均增加(P<0.05)，0.49N组和0.98N组HO-1的OD值较0.29N组均增加(P<0.05)，而0.49N组和0.98N组此指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同时间点4组大鼠牙周组织中HO-1 的OD值比较

2.5 不同时间点4组大鼠破骨细胞染色阳性面积比较 不同时间点4组大鼠破骨细胞染色阳性面积比较，差异有统计学意义(P<0.05)。干预前1天，4组破骨细胞染色阳性面积差异均无统计学意义(P>0.05)；干预第1、3天，0.29N组、0.49N组及0.98N组破骨细胞染色阳性面积较0N组均增加(P<0.05)，0.49N组、0.98N组破骨细胞染色阳性面积较0.29N组均增加(P<0.05)，而0.49N组和0.98N组此指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 不同时间点4组大鼠破骨细胞染色阳性面积比较

3 讨论

正畸是给予牙齿一定时间、一定强度的机械外力，从而使得牙齿发生移动，其中包括牙周组织、包绕牙根的牙槽骨发生改建，从而使牙齿可以移动到新位置[7-8]。机械外力作用下正畸牙移动的生物学基础是牙周组织改建，而与该过程密切相关的细胞为破骨细胞及成骨细胞，因此在牙根、牙周组织、牙髓无可逆性损伤情况下采用合适的力值促使正畸牙齿移动是正畸治疗的重点[9-10]。另外，患者身体状况、年龄、加力时间、加力大小、频率及牙槽骨密度等均会对正畸牙齿移动速度产生影响[11]。有报道[12]显示，哺乳期患者正畸牙移动速率较非哺乳者快。本文制备哺乳期大鼠模型，拟探讨不同正畸力值对哺乳期大鼠正畸牙周组织中HO-1、CC类趋化因子受体1及其配体的影响，以期为哺乳期正畸患者治疗方案的选择，提高正畸效果提供实验依据。

临床正畸牙齿移动的最佳力值为0.98 N，而大鼠磨牙是人磨牙的1/50，因此0.19N左右是较为合适的正畸力值[13]；有研究[14]发现，在0.39～0.59N初始力下可以观察到大鼠牙齿移动，因此本研究选择0N、0.29N、0.49N及0.98N的正畸力值。本组资料显示，干预后第1、3天，0.29N组、0.49N组及0.98N组CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表达量及破骨细胞染色阳性面积较0N组均明显增加(P<0.05)，0.49N组及0.98N组CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表达量、破骨细胞染色阳性面积均较0.29N组明显增加(P<0.05)。以上结果表明，随着正畸力值的增加，哺乳期大鼠的HO-1、CC类趋化因子受体1及其配体、TRAP破骨细胞染色阳性面积均发生显著变化，其中0.49N及0.98N时以上指标变化幅度较大，即干预效果最显著，分析原因：CCR1控制前体成骨与破骨细胞的分裂、分化、活化，其在成骨细胞、原始骨髓细胞、RANKL介导的破骨细胞、成骨细胞及破骨前体细胞中均有表达[15-16]。相关研究[2,17]证实，正畸力和患者机体内环境共同影响牙周组织的改建过程，如哺乳期患者正畸牙移动速率较未哺乳组加快，其原因可能与哺乳期患者牙槽骨密度降低有关。因此推测，CCR1可通过调控牙周组织成骨与破骨细胞分化从而参与牙周骨组织改建过程，与前人研究[4]结论相似。另外，干预后不同时间点，0.49N组及0.98N组CCR1、CCR3和CCL5 mRNA表达量及破骨细胞染色阳性面积比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。即0.49N组和0.98N组正畸力值不同时间点干预效果变化相对不明显。提示0.49N和0.98N正畸力值具有同样的正畸效果。由此可想，对哺乳期大鼠干预的正畸力值并非越大越好，0.49N可能是本研究大鼠的最适正畸力。

综上所述，正畸干预可通过促进哺乳期大鼠牙周组织中HO-1、CC类趋化因子受体1及其配体的表达发挥作用，但0.49N是否是哺乳期大鼠进行干预的最佳正畸力值有待后续研究进一步证实。