辛开苦降法对脾胃湿热证小鼠炎症因子和免疫功能的影响

曹 路 ，魏 岩，尤 文，柴晶美，段继昌，丁艳霞，周丽雅*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林省药品检验所，长春 130033）

国际癌症研究机构提供的癌症现状数据[1]显示，2018 年癌症死亡人数为960 万，且一半以上的死亡病例发生在亚洲，消化道癌占男性全部癌症的50%[2]。目前关于胃癌的研究[3]表明，胃癌的产生是源于胃黏膜炎症的日久不愈，逐渐演变成胃癌。从炎症[4]病变到癌症病变，促炎因子发挥至关重要的作用。在炎症致癌的过程中，炎症因子主要是通过改变体内的环境，进而影响原癌基因和抑癌基因的表达，导致细胞朝着癌变方向转化。脾胃湿热证病势缠绵、病程较长，主要表现为炎性病变。本实验将从血清Th1/Th2（促炎/抗炎）细胞因子IFN-γ/IL-4 的水平、胃黏膜上皮细胞凋亡蛋白Bcl-2 和抑癌基因p53 蛋白表达方面研究辛开苦降法对脾胃湿热证小鼠的作用机制。

医院节能项目制定的原则为：在安全的前提下，保障服务的品质，实现高效运行。医院结合各用能系统的特点，以科室为单位，提出节能方案。在能源管理平台的协助下，总务处各科室对提出的节能方案开展调研，分析可行性，上报获批后，确定节能方案。

但是从读者利用图书馆的信息行为来看，出现了借书量逐年下降、查找资料首选不一定是图书馆、入馆人次减少、对图书馆的利用以自习为主、传统咨询量减少、数字资源利用率在提高等变化。以陕西省7所211大学图书馆为例，从2011年到2016年，图书外借量均出现1万-32万不等的数量减少。

1 实验材料

2 月龄健康昆明小鼠（SPF 级）60 只，体质量20～30 g [辽宁长生生物技术有限公司，许可证号SCXK（辽）2019-005]。连朴饮药物组成：姜厚朴15 g，黄连10 g，制半夏10 g，石菖蒲15 g，焦栀子15 g，淡豆豉10 g，芦根30 g。将中药复方按照《医疗机构中药煎药室管理规范》[5]的煎煮方法，得到药液后低温浓缩至每1 mL 药液中含生药量1.2 g（根据《中药药理学》人鼠等效剂量换算），4 ℃冰箱中保存备用。南京建成公司提供的小鼠IFN-γ、IL-4 的ELISA 试剂盒和DAB 显色试剂盒；赛维尔生物科技有限公司提供即用型p53 一抗、Bcl-2 一抗、PBS 缓冲液。

思路剖析 由三角形的中位线和平行四边形的性质可知，BC∥EF且BC=2EF，所以求BC的长就转化为求EF的长．而在直角三角形EFN中，只知所以需求其锐角的某个三角函数值或找出三边之间的数量关系．由AB=OB和E为OA的中点想到连接BE，则BE⊥AC．又∠BCE=∠CEF=45°，所以△EBC为等腰直角三角形，得BM=EM=EF，则四边形EFMB为平行四边形，得运用勾股定理可得故

2 实验方法

3.2 小鼠胃肠组织形态学变化 实验结果显示，正常组小鼠胃黏膜层胃上皮结构完整，胃小凹结构清晰，上皮细胞排列紧密，固有层胃腺丰富，主细胞、壁细胞形态结构正常，未见明显炎症（图1-A）。与正常组比较，模型组黏膜层少见上皮细胞脱落；固有层局部可见胃腺减少，结缔组织增生（黄色箭头）；黏膜下层可见水肿，结缔组织排列疏松（红色箭头）；固有层与黏膜下层可见少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润（蓝色箭头）（图1-B）；与模型组比较，连朴饮低、中、高剂量组随药物浓度增加，黏膜层上皮细胞脱落明显减少，固有层与黏膜下层淋巴细胞与中性粒细胞浸润明显减轻。连朴饮高剂量组除黏膜层局部可见少量上皮细胞脱落外，固有层胃腺丰富，主细胞、壁细胞形态结构正常，未见明显炎症（图1-CDE）。阳性药组固有层胃腺丰富，主细胞、壁细胞形态结构正常，黏膜下层可见水肿，结缔组织排列疏松，并伴有少量淋巴细胞浸润（图1-F）。

2.2 动物给药 正常组：常规饲养，每日10:00 定时投放食物和水，温度25～28 ℃、湿度70%～80%。湿热模型组：采用内因湿热法造模[6]，在造模之前12 h开始禁食但不禁水。用高脂高糖饲料和蜂蜜水喂食。造模成功后，生理盐水灌胃，每日1 次。连朴饮低、中、高剂量组：造模成功后，连朴饮给予小鼠灌胃，每日1次。阳性药组：造模成功后，黄芩滑石汤灌胃，每日1次。共治疗7 d。给药期间自由进食、饮水。每天观察其一般情况，记录精神状态、进食、活动和大便情况。

2.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 进行统计学分析，各组数据均以均数±标准差（）的形式进行数据的统计描述。组间比较采用方差分析。

3.1 小鼠血清中IFN-γ、IL-4 以及IFN-γ/IL-4 的表达水平 见表1。

3.3 小鼠胃肠组织Bcl-2 和p53 蛋白表达水平 实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠胃肠组织Bcl-2 和p53 蛋白表达水平明显升高；与模型组比较，连朴饮低、中、高剂量组Bcl-2 蛋白表达明显降低（P＜0.05），可抑制Bcl-2 蛋白表达；连朴饮低、中、高剂量组均可明显抑制p53 蛋白的表达（P＜0.01 或P＜0.05）（见图2）。

2.3 标本采集 在取材的前一天开始禁食不禁水，取材前共禁食24 h。眼球取血1 mL，静置1 h 后以3 000 r/min 离心10 min，取上层血清置于EP 管中，于-20 ℃冰箱中保存待测。小鼠眼球取血后，脱颈处死，剪取胃窦、十二指肠、大肠、回肠、盲肠，上述组织各取一半置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，脱水，浸蜡，包埋，3 μm 切片，HE 染色。另一半置于液氮中冷冻保存，做WB 实验。

3 结果

在当前对蛋鸡养殖影响最大的应该莫过于鸡蛋的药物残留超标问题，随着国家食品安全监管的不断加强，加上农业部推行的“动物用抗菌素减量化使用”行动，抗生素的使用趋于规范化，药物饲料添加剂也逐渐地退出，以往的蛋鸡疾病防控措施已经不再适用，由于抗生素的不规范使用造成的鸡蛋药物残留超标问题已经成了许多蛋鸡养殖场的噩梦，许多养殖场因此受到了处罚，甚至还有的面临着牢狱之灾。

表1 小鼠血清中IFN-γ/IL-4 表达水平（，n =10）

表1 小鼠血清中IFN-γ/IL-4 表达水平（，n =10）

注：与正常组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

2.1 分组与造模 小鼠适应性饲养1 周后，随机分成6组，分别为正常组，模型组，黄芩滑石汤组，连朴饮低、中、高剂量组，每组10 只，雌雄各半。空白组普通饲料喂养，实验组给予高脂高糖饲料喂养，即在普通饲料喂养的基础上，加用200 g/L 蜂蜜水自由饮用，且隔日按小鼠体质量灌服油脂10 g/kg，10 mL/kg 白酒（红星二锅头56 度，北京红星股份有限公司）。共30 d。

图1 小鼠胃肠组织形态学改变（HE 染色×200）

2.4 指标检测 HE染色法观察胃肠组织形态学改变，检测血清中IFN-γ、IL-4 以及IFN-γ/IL-4 表达水平，WB 法检测胃黏膜上皮细胞凋亡基因相关蛋白Bcl-2、p53 的表达。

4 讨论

图2 小鼠胃组织Bcl-2 和p53 的蛋白表达水平

脾胃湿热证是脾湿胃热，脾失健运，胃失纳降形成的证候。主要表现为：脘腹胀满，厌食呕逆，大便黏腻，小便色黄，头身困重，舌苔黄腻，脉滑数或濡数。湿邪分为外来之湿和脾胃运化失职内生之湿2 种[7]，具有重浊、黏滞，易夹杂他邪致病的特性。湿邪不仅可以造成消化系统的疾病[8]，还会引起呼吸系统、泌尿系统等的疾病，但以消化系统疾病为主。陈一斌等[9]研究表明，通过治疗脾胃湿热证的中医疗法治疗慢性萎缩性胃炎治愈率高达90%。周晓华等[10]认为脾脏是人体最大的外周免疫器官，脾胃湿热证的患者脾的正常生理功能受到抑制，机体的免疫功能出现异常。中医辛开苦降法治疗脾胃湿热证临床上取得良好的疗效[11]，辛开苦降法代表方剂是连朴饮，具有清热化湿，理气和中的功效。现代药理研究[12]提示，连朴饮能降低脾胃湿热证胃黏膜炎症的产生，抑制IL-6、NF-kb的表达，调节机体内环境，使胃黏膜细胞的增殖与凋亡趋于动态平衡，阻止其向胃癌的方向转化。钱益啸等[13]认为连朴饮能降低ALD、ADH 和β-EP 的表达水平，通过调节机体的水电解质平衡达到清热祛湿，恢复脾胃生理功能的目的。杨春波等[14]研究表明，脾胃湿热证导致人体免疫调节功能失常，容易受到病原微生物的侵袭。娄莹莹等[15]认为，慢性萎缩性胃炎的治愈与Th1/Th2 的平衡有关。高慧等[16]研究表明，糜烂性胃炎的治愈可以逆转Th1 向Th2 细胞漂移效应，恢复Th1/Th2 的平衡。张英平等[17]认为，Th1/Th2 失衡是引起免疫系统疾病的重要因素，而IFN-γ 是标志性的Th1 型细胞因子，IL-4 可以促进Th2 细胞增殖，Th1 和Th2 相互制约维持稳态，当Th1/Th2 的平衡失调时，机体的免疫功能失常，导致病原微生物侵袭人体，产生炎症。实验结果显示，与正常组比较，模型组小鼠血清中IFN-γ、IL-4 表达明显升高；与模型组比较，连朴饮高剂量组小鼠血清中IFN-γ、IL-4表达明显降低。

p53[18-19]是细胞中重要的抑癌因子，其分为野生型和突变型2 种：野生型p53 能够抑制肿瘤的形成，促进肿瘤恶性细胞的凋亡，维持正常细胞的生长；突变型p53 出现在50%的癌症中，突变型p53 失去肿瘤抑制功能，反而促进肿瘤的形成。p53 抑制肿瘤形成的机制[20]是通过诱导细胞周期停滞或凋亡完成的。p53表达程度越高，则肿瘤预后越差[21]。研究表明[22-23]突变型p53 蛋白在肿瘤中处于高水平状态。突变型p53所表达的蛋白产物结构相对稳定，以便用于癌细胞检测。本研究表明，连朴饮治疗后小鼠p53 蛋白表达明显降低。

B 淋巴细胞瘤（Bcl）-2 基因家族是细胞中重要的凋亡相关基因[24]，能够编码两类蛋白：一类是抗凋亡蛋白Bcl-2，能够抑制细胞凋亡；另一类是促凋亡蛋白Bcl-2 相关X 蛋白（Bax），能够促进细胞凋亡。正常体内抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白都会有，其表达相对量的多少能控制细胞凋亡。细胞凋亡[25]能够调节细胞数量维持动态平衡，当衰老细胞凋亡不足时容易引发癌症。Bcl-2 蛋白在正常细胞中表达较低[26]，在肿瘤细胞中表达较高。本研究发现连朴饮不仅降低p53 表达，也抑制了Bcl-2 的表达。

综上，连朴饮能够降低炎症因子，促进脾胃湿热证细胞凋亡，达到治疗脾胃湿热证的作用。