过敏性鼻炎中Th9 细胞亚群的研究进展

何玮，梁兴明，文芳芳

南宁市第二人民医院耳鼻咽喉科，广西南宁 530031

耳鼻喉科疾病中最为常见的类型包括变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)，该疾病不威胁患者生命，但在一定程度上会对患者的生活及工作造成损害。近几年AR 的发病率呈逐年递增趋势发展， 以往多数学者指出，AR 作为过敏性反应，Th2 细胞在其发生过程中有所参与， 而Th1 细胞在该过程中含量相对较低。 IL-4、IL-5 以及IL-13 由Th2细胞分泌后刺激机体产生免疫球蛋白E，同时使机体的部分细胞产生浸润情况，例如嗜酸粒细胞、肥大细胞等，上述情况持续发展后引发机体出现一系列的炎性反应[1]。 针对AR 的相关临床特点， 机体内存在的部分免疫机制中Th2 细胞存在一定的介导作用，而该类免疫机制可对以上临床特点进行解释，然而解释无法完整阐述AR 的免疫机制。Dimitri Poddighe[2]研究后表明，在部分过敏反应中，Th2细胞应答起到主导作用， 在该类过敏反应引发的炎症中加强Th1 细胞产生的炎性反应，对症状表现无明显影响，证实Th1/Th2 细胞水平失衡不是引发过敏性疾病的唯一病因。 最初IL-9 被指认为是由肥大细胞、T 细胞等细胞分泌的细胞因子， 具有多重功能， 属于Th2 型细胞因子之一， 但最新研究指出其为新型T 辅助亚群， 被命名为“Th9”亚群，与Th2 细胞亚群存在一定差异，可分泌大量IL-9 并且具有免疫反应特异性。该研究旨在综合分析Th9细胞的生物学特征，并针对AR 中Th9 细胞的应用现状进一步研究，现报道如下。

1 Th9 细胞简介

李安等[3]学者在2008 年通过对不同辅助性T 细胞亚群产生的细胞因子进行聚合酶链反应、细胞内染色研究，结果显示初始CD4+T 细胞在TGF-β、IL-4 存在的前提下被激活后，可使IL-9、IL-10 的含量明显增加，其他Th2 细胞因子无明显变化，证实Th2 细胞不是产生IL-9 的细胞。在该情况下产生IL-9 的细胞亚群与Th1、Th17、Treg 亚群均存在一定差异，该现象表明该亚群为一种新型辅助性T细胞亚群。 经相关研究后，Th9 细胞的各种功能纷纷得到证实，具有大量增殖以及促进T 细胞增殖反应的特点。 经研究发现Th9 细胞中无T-bet、GATA3 等专一性转录因子表达， 更加证实Th9 细胞亚群为独立于Th1、Th17 以及Treg 细胞以外的新型亚群，Th9 为明确各类疾病的免疫调节机制奠定良好的理论基础。

2 由Th9 细胞分化而来的转录因子

细胞亚群功能、 分化过程中特异性转录因子起到关键性作用。ETS 转录因子家族成员中的PU.1 经抗原受体、TGF-β 共同刺激诱导后， 在Th9 细胞中相比于Th1、Th2、Th17 细胞表达水平明显更高[4]。PU.1 与Il9 启动子结合后，使染色质修饰酶大量聚集，以此达到重构染色质的目的，进而促进IL-9 基因的转录过程[5]。CD4+T 细胞在缺乏PU.1 条件下其生成IL-9 的速度明显降低，PU.1 在TGF-β 存在情况下出现异位表达，加快Th2 转化为Th9 的过程，同时增强Th9 表达水平，加快IL-9 的生成速度，但对Th1、Th17、Treg 中IL-9 的表达无明显影响[6]。 由此可知，PU.1是现阶段Th 细胞中唯一一类在生成IL-9 过程中具有诱导作用的转录因子。PU.1 基因是Th9 细胞中的特殊存在，该因子可在无IL-4- STAT6 信号诱导的情况下， 诱导下游的TGF-β 信号通道产生效果。给予Sfpi1 基因在Th9 细胞诱导的培养条件， 结果显示基因中未出现PU.1 编码差异表达的情况， 以上结果表明， 非依赖信号机制中的SMAD 在TGF-β 诱导下可调节PU.1 表达。 Th9 分化过程中具有中地位的转录因子为干扰素调节因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4)，T 细 胞 存 在IRF4 缺 陷 导 致Th9发育出现异常。 李晓燕[7]研究发现存在IRF4 缺陷的小鼠中的变应性炎症反应强度处于较低水平， 相比于正常小鼠降低幅度非常明显，IRF4 缺乏可能是导致该现象的主要原因， 机制是该因子含量相对缺乏后在一定程度上影响Th2、Th17、Th9 细胞发育，进而影响变应性反应。

IRF4 可以与或BATF 属于活化蛋白(activator protein，AP)1 家族转录因子之一，其与P U.1、IRF4 可在DNA 水平上达到整合。 Th9 细胞的转录过程中IRF4、BATF 起到共同诱导作用。 Th9 细胞经IL1β 刺激后其会存在Th1 细胞转录因子IRF1 表达的现象， 该因子可与il9、il21 启动子直接结合，进而促进以上两种因子大量分泌。 现阶段尚未明确IRF1 在Th9 的极化过程中是单独参与还是联合其他转录因子共同作用。 另外，在Th9 细胞的分化过程中存在一定参与的STAT6 以及GATA3 两类转录因子， 可在Th2 细胞上表达。在IL4R 信号参与的前提下，STAT6 磷酸化后在Th9 细胞的分化过程中进行一定程度的参与并发挥重要作用。而PARP-14 作为STAT6 的辅助因子，对Th2细胞的发育过程及IL-9 的产生过程均具有一定程度的影响。 而作为Th2 发育过程中具有重要作用的因子STAT3，相比于STAT6 在Th9 发育过程中可被激活， 但并无明显影响。

STAT 6 磷酸化后诱导GATA3 表达，Th9 细胞分化过程中GATA3、STAT 6 存在重要作用。 宋敏[8]研究发现小鼠存在STAT6 缺陷、GATA3 缺陷时无Th9 细胞生成，该现象证实以上观点。 但某研究数据显示，IL-9 基因的转录过程中GATA3 并未直接参与调控， 而是通过下调Foxp3 对Th9 发育产生间接影响。

3 IL-9

最初IL-9 克隆称为“P40”，对T 细胞生长具有一定的促进效果，TCGFIII 属于T 细胞生长因子之一， 被指出与P40 结构完全一致。 将以上两种物质同时进行研究，获得数据显示，CD4+T 细胞在产生TCGFIII 的同时， 可产生定量的MEA 因子，该因子在一定程度上可提升肥大细胞的生长活性。 经研究证实P40、TCGFIII、MEA 为同一种细胞因子，最终统一命名为IL-9[9]。

Il 9 基因编码蛋白由144 个氨基酸组成，其中含有14 kD 的糖蛋白以及18 个典型氨基酸信号肽。从核酸水平角度分析，人和鼠的IL-9 同源性接近70%，而从蛋白水平分析其同源性为55%。 在人类身体中IL-9 基因的主要位置为Th2 细胞因子基因簇， 该基因簇位于第5 号染色体长臂上，而该基因在鼠类中的主要分布位置为第13 号染色体上，基因构成极为相似，长度为4 kb，含有外显子、内含子的数量分别为5 个、4 个[10]。 激活蛋白AP-1 与AP-2 转录因子特异性的结合序列，在人、鼠体内是IL-9 基因的启动子区域。 另外，该区域中的某结合区域专供IFN 调节因子1 结合，该区域位于5’端位置。 对IL-9 分别在T 细胞、骨髓单核细胞中的产生水平进行分析，获得数据显示IL-9 分泌含量与IL-1 的上调有关。 以骨髓单核细胞进行深层次的探索研究，结果显示IL-10、LPS、Kit 配体是除IL-1外对IL-9 产生过程具有协调作用的因子。 GATA-1 在骨髓单核细胞产生的IL-9 转录过程中具有关键作用。在IL-4、TGF-β 的协同刺激下CD4+T 细胞中对IL-2 依赖性增强，进而加快IL-9 的生成，该过程中IL-9 生成水平因IFN-γ 抑制受到一定限制。 综合以上研究数据分析，IL-9 的生成来源较多， 例如T 细胞亚群中的多种Th2 细胞。 现有的研究文献中，部分学者受到当时的技术条件限制，未能获得足够的抗IL-9 抗体进行研究，进而使IL-9/IL-4 双阳细胞在人体内的水平等相关延伸研究未能顺利施展， 造成其未能明确Th2 细胞在分泌IL-4 的同时是否是产生IL-9 的主要来源， 也未能针对其它特定T 细胞亚群中IL-9 的分泌量进行研究。

Trakaki Athina[11]进行同方向研究后，指出IL-4、TGFβ 在CD4+T 细胞亚群中， 属于主要的生长因子及分化因子，促进IL-9 大量产生，因此以Th9 细胞亚群为该亚群进行命名。测定IL-9、IL-4 特异性单克隆抗体在该菌群中的水平时，采用流式细胞术进行，获得结果表明，分泌IL-4的部分残存在Th9 细胞群中的细胞中， 未检测到IL-9 分泌， 该细胞菌群中也未检测出IL-4、IL-9 双阳细胞存在。经某项研究发现，IL-9 在Th2 细胞上清液中存在， 证实Th9 样细胞是IL-9 的来源之一， 与Th2 细胞中分泌IL-4的细胞无明显关联。

作为T 细胞生长因子的IL-9， 可直接对B 细胞产生作用效果， 在一定程度上对炎症细胞及正常组织细胞产生影响，同时使嗜酸粒细胞、淋巴细胞、肥大细胞数量明显增加，进而对Ig E 的分泌水平起到促进效果，使肥大细胞对过敏原的反应强烈程度增加， 提升黏蛋白的表达水平，同时刺激炎性细胞因子的分泌。

4 AR 患者中的Th9 水平

IL-9 在AR 患者血清中的水平与其鼻痒、 打喷嚏、长时间流等症状的严重程度呈显著正向相关， 与鼻塞存在较弱的负向相关[12]。 AR 患者在变应原免疫治疗前后，其IL-9 阳性细胞、 嗜酸粒细胞在鼻黏膜中的数量存在显著相关性， 免疫治疗持续2 年后，IL-9 蛋白、mRNA 的水平均出现明显降低。

采用离体过敏原对哮喘、AR 等特应性个体患者进行刺激，刺激的主要对象为体内的外周血单个核细胞，刺激后获得的实验室数据显示，IgE 特异性过敏原与IL-9 水平二者间具有明显的相关性， 其特异性强度远高于IL-13、IL-5 等其他因子， 哮喘患者体内的IL-9 水平相比于AR 患者明显更高。

刺激AR 患者的过敏原，检测患者的鼻黏膜组织中各类因子水平，数据显示，IL-9 阳性细胞、嗜酸粒细胞局出现含量上升的情况， 另外人钙激活氯离子通道Ⅰ型在检测组织中的表达水平相应增加， 但T 细胞数量在组织中的含量未检测到明显变化。

胡晓春[13]在构建AR 小鼠模型的过程中，选取的基础为卵清蛋白致敏，对成功构建的小鼠模型进行检测，方法为免疫组织化学SABC 法，鼻黏膜上皮细胞、黏膜下层腺体细胞的胞浆内部、 固有层炎性细胞均是IL-9 免疫反应阳性表达的主要位置， 该因子表达水平在末次激发呈时间效应关系， 随时间延长出现先增后降的水平变化。 AR鼠模型经实时荧光定量PCR 法测定， 测定的位置为鼻黏膜组织检测目标为转录因子PU.1 mRNA、IL-9 的含量变化， 该过程中对小鼠鼻黏膜组织中的IL-9 蛋白表达情况进行测定，方法选用流式微球术，数据显示IL-9 mRNA/蛋白、 转录因子PU.1 mRNA 在AR 鼠鼻黏膜组织中均呈现较高的表达水平。 IL-9 mRNA 在鼻黏膜组织中的表达水平与转录因子PU.1 mRNA 表达水平呈显著正相关。 在AR 鼠模型基础上使用流式细胞术检测，发现Th9 细胞在鼻黏膜中高水平表达。

5 结语

随着Th9 细胞亚群的发现，使研究AR 疾病的治疗找到新方向。 Th9、IL-9、PU.1 均在AR 疾病的发展过程中有所参与并发挥重要作用，但具体作用机制尚未明确。 可将特异性中IL-9 抗体、 敲除PU.1 基因等作为研究切入点，进一步探究以上因子在AR 中的作用机制进行研究，Th9与AR 的具体联系， 可根据上述因子与免疫成分Th17、Treg 等之间的相互关系进一步确定。