流式细胞仪在本科生“分子生物学”课程实验教学中的应用与实践

牛熙 李升 齐芬芳

[摘 要]为了能够让本科“分子生物學”实验课程更为新颖和丰富，提高大型仪器流式细胞仪的使用效率，根据分子生物学课程的实验教学特点，结合理论教学的同时，在实验课程教学中使用流式细胞仪开展细胞凋亡和细胞周期检测实验。通过实验课的开展，锻炼学生基本实验技能，为今后科研工作打下良好的实验基础。

[关键词]流式细胞仪;分子生物学;实验课程

[基金项目]2019年贵州大学本科教学工程建设项目“贵州大学分子生物学课程本科教学工程建设项目”（JG201977）;2018年贵州大学培育项目“香猪卵巢繁殖力相关lncRNA的鉴定与生物学功能分析”（黔科合平台人才〔2018〕5781-40号）;2015年贵州科技厅与贵州大学联合基金项目“PDIA4基因多态性与香猪产仔数性状关联研究”（黔科合LH字〔2015〕7673）

[作者简介]牛 熙（1987—），女，贵州贵阳人，硕士，在读博士，贵州大学农业生物工程研究院实验师，研究方向为动物分子生物学;齐芬芳（1986—），女，湖南株洲人，硕士，贵州大学农业生物工程研究院博士研究生，遵义医药高等专科学校讲师（通信作者），研究方向为微生物及动物分子生物学。

[中图分类号] G642.0[文献标识码] A[文章编号] 1674-9324（2020）45-0-03[收稿日期] 2020-05-14

20世纪50年代以来，以实验为基础的分子生物学作为生物学的前沿学科，其实验课的教学内容就十分重要。[1-3]以贵州大学为例，目前本科生虽然开展的分子生物学课程，但仍以一些基本的实验操作为主，如动物基因组DNA提取，PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、目的片段胶回收、大肠杆菌感受态的制备、目的基因连接与转化、质粒提取、植物叶片RNA的提取等，实验项目较为简单，造成本科生科研经验和科研能力不足等问题。高校大型精密仪器作为提升实验教学质量、培养高素质人才，提高科研水平的重要保障条件[4-6]，在本科生实验教学中增加大型精密仪器的使用，可让本科生在掌握基础实验技术的同时，为今后的科研提供较好的学习平台。目前为了提升本科生的科研技能，贵州大学虽然开展了本科SRT项目设计、大学生创业创新项目和实验室设备管理处开放项目[7]，但只受益于部分本科生，大型精密仪器在本科实验中尚未普及。

流式细胞仪（flow cytometer，FCM）作为大型精密仪器，能对处在直线、快速、流动状态中的单个细胞或生物颗粒进行分析及精确分选，目前已广泛应用于分子生物学和临床检验等领域[8-11]。因此，在本科实验教学中加入流式细胞仪的掌握，除了能够提高大型精密仪器的使用效率，同时让更多的本科生能够有机会熟悉和掌握大型精密仪器的原理、方法和操作，提升学生的科研竞争力。

目前贵州大学农业生物工程研究院通过建设，已拥有了能够面向校内外科研人员的生物科学大型仪器共享平台[12]。目前该平台主要开展了对外分析测试服务，针对生物学学科教学主要是以参观教学为主。我院流式细胞仪型号为BDFACS Aria Ⅱ（分析/分选型），除用于药学相关研究外，还在本校的实验室设备管理处开放项目资助下，结合理论课向部分本科生开放细胞凋亡、细胞周期以及黏蛋白13（mucin13，MUC13）与产肠毒素大肠杆菌F4ac型的结合实验，取得了较好的实验效果。为了能够让更多的本科生了解流式细胞术，计划在本科生“分子生物学”课程实验教学中增加相关实验。

一、流式细胞仪的结构和工作原理

流式细胞仪的基本结构主要包括以下几个部分：（1）光学系统。由于流式细胞仪器主要是通过对光信号的采集和检测来对样品进行分析的，因此光学系统在流式细胞仪中有着最为重要的作用。它由激发光源和若干组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成。（2）电子系统。电子系统作为流式细胞仪的大脑，主要负责将探测器产生的光电流信号进行数字化，处理信号并储存相关数据用于后续分析。该系统主要由光电转换器件、放大器和信号处理电路组成。（3）液流系统。该系统是由鞘液系统和样品流动系统组成，主要负责将测试样本从样品管转移至流动室，在鞘液的作用下，得到准确的细胞荧光信息，然后样品被分选出来（在细胞分选仪中）或移到废液中。（4）数据系统。流式细胞仪的数据系统主要是通过计算机以及分析软件保障仪器运行、数据的采集和分析。除上述固定基础结构外，具有分选功能的流式细胞仪还包括分选系统，该系统能根据某类细胞的特性，给这类细胞的液滴充以特定电荷，带电荷的液滴进入偏转板静电场时发生向左偏转或向右偏转，落入固定的收集器内，不带电的液滴则直接进入到废液槽中，从而达到获得特定细胞的目的[13-15]。

二、实验教学设计

以敌敌畏对人肾细胞凋亡及细胞周期的影响为研究对象，结合学校实际情况、实验运行成本及操作难度、时间等因素，计划在本科生《分子生物学》课程实验教学中开展细胞凋亡检测和细胞周期检测2个实验。

流式细胞仪的教学可分成理论教学和实验操作两个部分。理论教学部分主要以教师集中授课方式进行，教学内容主要分为三个部分：（1）课堂讲授流式细胞术的发展简史及流式细胞仪的结构和工作原理;（2）采取仪器现场观摩、学生分组轮换的形式向学生阐述待测标本经过仪器的各结构的情况，将流式细胞仪的检测原理拓展并贯穿至仪器的各个结构中，使学生对流式细胞仪有个比较清晰的认识;（3）根据实验指导向学生讲授细胞凋亡检测和细胞周期检测实验的原理、方法、步骤、注意事项及考查方式等[13]。实验操作部分则以学生自主学习为主：首先在保障仪器对外服务的同时，采取现场教学的方式对学生进行仪器使用培训;然后根据仪器使用情况及班级人数，按照分组进行细胞凋亡和细胞周期的检测;最后分析实验结果，完成实验报告[6]。

三、实验实操部分课程设计

（一）仪器使用培训

仪器使用培训的教学内容主要包括4个方面：（1）演示开机程序：首先确认是否需要添加鞘液及倾倒废液;然后逐一打开稳压电源、计算机、仪器主开关、激光光源控制器、控制软件;最后强调开机过程中的注意事项。（2）运行仪器控制软件，讲解软件的构成和使用。（3）利用BD公司培训用荧光微球，用单色和双色实验演示细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI双色）及细胞周期（PI单色）的分析检测方法。（4）演示关机程序及强调日常维护的注意事项。

（二）实验操作设计

1.实验一：敌敌畏对人肾细胞凋亡的影响。制备293T人肾细胞悬液（1×106cells/mL）。向12孔细胞培养板板中加入1mL细胞悬液进行培养至贴壁（5%CO2、37℃）后，加入含有不同浓度敌敌畏（可由学生自行设计）的培养液处理1h。用胰蛋白酶消化细胞后收集于1.5mL的离心管中，低速短时离心后（1000r/min离心3min），加入PH7.5的磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗2～3次。将清洗后的细胞制成单细胞悬液（1～5×106 cells/mL），根据细胞数量加入适量的Binding Buffer悬浮细胞（100～500μL）。根据试剂盒说明书，向制好的悬浮细胞中加入适量Annexin V-FITC混匀后，再加入适量Propidium Iodide（PI）混匀，反应5～15min（室温避光）。所有样品必须在1h内进行检测[16，17]。

2.实验二：敌敌畏对人肾细胞周期的影响。取293T人肾细胞（浓度：1×106cells/mL;状态：对数生长期）接种于12孔细胞培养板中。在5%CO2、37℃的条件下培养细胞贴壁后，向293T人肾细胞加入含有不同浓度敌敌畏（可由学生自行设计）的培养液。1h后，用胰蛋白酶处理并收集细胞。用PBS处理细胞后（2～3次），制成适当浓度的单细胞悬液。取3mL单细胞悬液，1000r/min离心3min，去除上清液后，逐滴加入预冷的无水乙醇1.5ml（乙醇终浓度为75%），-20℃固定过夜。取出固定后的样品，低速离心去除上清液。用预冷的PBS重悬细胞后，低速离心收集细胞。加入RNaseA 150μL重悬细胞（需用PBS稀释，浓度为250～500ug/ml）。最后加入150μL PI工作液，4℃避光染色30min，上机检测[16]。

（三）结果与分析

1.实验一：敌敌畏对人肾细胞凋亡的影响。在正常人肾细胞中，磷脂酰丝氨酸（PhosphatidyISerine，PS）通常只分散在细胞膜脂质双层的内侧，经过不同浓度敌敌畏处理后，人肾细胞就会发生不同程度凋亡。在细胞发生凋亡的早期，细胞膜中的PS会由细胞膜脂质双层的内侧翻向外侧。Annexin V作为Ca2+依赖性磷脂结合蛋白（分子量为35～36kD），能特异性结合PS，故可利用用异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）标记后的Annexin V鉴别出发生早期凋亡的细胞。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）作为一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，而在中晚期凋亡细胞或者死亡细胞中，细胞核能被透过细胞膜的PI染红。因此通常在细胞凋亡试剂盒中，使用Annexin V与PI来检测处于不同凋亡时期的细胞[11，12]。实验操作及数据分析均有学生自己独立完成。流式细胞仪检测细胞凋亡的结果后，学生利用软件所给的双参点数图（图1）[12]，区分活细胞、早期凋亡细胞和死细胞，同时总结不同浓度敌敌畏处理人肾细胞后，细胞凋亡率、早期凋亡率、晚期凋亡率，分析敌敌畏对人肾细胞凋亡的影响。

2.实验二：敌敌畏对人肾细胞周期的影响。在不同细胞周期状态下，DNA的含量是不同的，其中G2/M期细胞的核酸含量是G0/G1期细胞的2倍。熒光染料PI可与双链DNA分子特异性的结合，荧光强度的多少可以用来确定细胞中DNA的含量，从而明确细胞所处的周期状态[16]。实验操作及数据分析均有学生自己独立完成。流式细胞仪检测细胞周期的结果后，学生利用MODFIT软件分析单参数直方图（图2），学会分析细胞周期图，分析细胞周期各时期所占比例，从而明确不同浓度敌敌畏对人肾细胞周期的影响[17]。

四、结语

目前，流式细胞仪已在医学、药学、细胞生物学等课程的实验教学中得到了应用，但在分子生物学课程中的实验教学较少。随着多学科交叉研究越来越广泛，将流式细胞仪应用在分子生物学课程实验教学中就显得比较重要。将该实验课引入到本科生的分子生物学实验教学课程，在最大程度发挥学校大型仪器资源优势的同时，让学生掌握基本实验技能，提高学生科研分析能力。

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Discussion on the Application of Flow Cytometrer in the Experimental Teaching

of "Molecular Biology" for Undergraduates

NIU Xi1， LI Sheng1， QI Fen-fang1，2

（1. Institute of Agro-Bioengineering， Guizhou University， Guiyang， Guizhou 550025， China;

2. Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi， Guizhou 563006， China）

Abstract： According to the characteristics of experimental teaching in Molecular Biology， an opinion was proposed that flow cytometrer was used to detect cell apoptosis and cell cycle in experimental teaching of "Molecular Biology" for undergraduates. These experiments are carried out in order to enrich the content of experimental courses and improve the utilization rate of instruments. Through the practice of these experiments， students can improve their experimental skills. The course also can lay a good foundation for the technology work and scientific research and design in the future.

Key words： flow cytometrer; Molecular Biology; experiment course