m6A甲基化修饰在血液系统恶性肿瘤中的作用研究进展

朱屿倩，吴凌云

上海交通大学附属第六人民医院血液科，上海 200233

血液系统恶性肿瘤是一种造血细胞的恶性克隆性疾病，通常表现为造血细胞出现增殖失控和分化障碍，具有异质性高、预后较差等特点，迄今为止尚缺乏有效的治愈方法。血液肿瘤的发生是一种复杂的多步骤过程，多年来的研究[1-2]显示，其发病与基因组异常、表观遗传学改变、骨髓造血微环境调节异常和免疫系统紊乱等多种因素有关。

表观遗传修饰是一种影响基因转录及翻译而核苷酸序列不发生改变的基因表达调控方式，能够在DNA和染色质结构修饰、RNA稳定性以及转录活性水平上进行调控进而影响基因表达，其内容主要包括DNA甲基化修饰、组蛋白共价修饰、染色质重塑和RNA干扰等。目前，以N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰为代表的表观转录组学已成为研究热点，即针对其在转录组水平上的表观遗传学改变进行研究。与DNA甲基化相似，m6A甲基化修饰可在不改变碱基序列的条件下介导基因表达的转录后调控。近年来随着高通量m6A测序技术的发展，越来越多的研究发现m6A及其相关因子通过调节骨髓造血微环境中多能干细胞的自我更新、增殖与分化，参与骨髓的造血发育。新近的研究[3]表明，m6A修饰异常与血液系统恶性肿瘤的发生与发展密切相关。本文就m6A甲基化修饰的生物学特征、造血调控功能以及其在血液系统恶性肿瘤中作用的研究进展进行综述，为开发基于m6A修饰异常的相关血液肿瘤新的分子靶向疗法提供科学依据。

1 m6A甲基化修饰的生物学特征

1.1 m6A甲基化修饰的酶系统

m6A是位于腺嘌呤第6位氮原子上的甲基化修饰，为真核生物mRNA最常见的一种修饰方式。m6A甲基化修饰广泛分布于mRNA和非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）中，在mRNA剪接、微小RNA（microRNA，miRNA）的加工成熟、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）介导的转录抑制等多种RNA的代谢过程中发挥重要作用[4-5]。m6A最早于1974年在肝癌细胞的mRNA中被发现[6]，此后亦在小鼠、酵母等多种真核生物中被检测，其生物学功能涉及细胞分化、有丝分裂、免疫稳态等多个方面。m6A甲基化修饰是动态可逆的酶促反应过程，mRNA在编码器（writer）即m6A甲基转移酶的催化下发生甲基化，这一过程可在消码器（eraser）即m6A去甲基化酶的催化下被逆转，且甲基化的mRNA能够被读码器（reader）即m6A结合蛋白识别。m6A甲基转移酶为由甲基转移酶样3（methyltransferase like 3，METTL3）、METTL14及Wilms′肿瘤蛋白1相关蛋白（Wilms′ tumor 1-associating protein，WTAP）等组成的巨型复合物。在催化m6A形成的过程中，METTL14与METTL3形成异二聚体发挥催化作用，并在WTAP的招募下结合到mRNA上，调控m6A修饰水平的动态变化[7]。m6A去甲基化酶的成分主要包括脂肪量和肥胖相关（fat mass and obesity associated，FTO）基因和α-酮戊二酸依赖的加双氧酶ALKB同源蛋白5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5）[8-9]。 与 DNA甲基化相似，m6A甲基转移酶与去甲基化酶通过调控mRNA序列m6A甲基化修饰的动态变化来影响转录后的基因表达水平。m6A结合蛋白的成分包括YTH结构域蛋白家族成员和异质性胞核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP）[10-11]；其中，前者包括YTHDF（YTH domain family protein）和YTHDC（YTH domain containing）共2个亚型，YTHDF亚型的结合蛋白分别为YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3，而YTHDC亚型的结合蛋白为YTHDC1和YTHDC2。m6A结合蛋白通过识别甲基化的mRNA发挥不同的生物学功能，例如YTHDF1主要影响m6A修饰基因的翻译效率以促进蛋白质合成[11]，而YTHDF2则介导靶基因mRNA的降解以调节mRNA的稳定性[10]从而调控体细胞基因表达水平。目前，m6A修饰酶的种类和生物学功能尚未被完全阐明，而m6A新的修饰酶如METTL16、KIAA1429等被相继报道[12]，可见m6A甲基化修饰的动态调控机制及其潜在的生物学功能依然具有广阔的探索空间。

1.2 m6A甲基化修饰的上游调控因素

m6A的分布在真核生物中非常保守，近年来利用高通量m6A测序技术揭示mRNA的m6A甲基化修饰主要分布于终止密码子、3′非翻译区（3′-untranslated regions，3′-UTRs）以及长外显子区域，且m6A的核心序列为RRACH保守序列（R通常为A和G，H通常为A、C和U）[13-15]。另外，92%～96%的m6A修饰区域能够与miRNA反向互补，提示miRNA可以通过与mRNA序列互补配对参与调节mRNA的m6A修饰的发生[16]。miRNA是真核生物中一类长度为18～24个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其在基因表达的转录后调控中可发挥关键作用。成熟的miRNA可通过与Argonaute蛋白（Argonaute protein，AGO）形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complexes，RISCs），并引导RISCs通过碱基互补与miRNA具有同源性的靶mRNA结合，引起靶基因mRNA的降解或翻译受阻而抑制肿瘤生长相关基因的表达[17]，从而实现对机体生长、发育及肿瘤生成等细胞生物学过程的调控。miRNA的成熟需要miRNA前体内切酶Dicer（属于RNase Ⅲ家族）的参与[18]。Chen等[16]通过在HeLa细胞中敲低Dicer以降低miRNA的水平后发现，m6A甲基化修饰的水平显著下降，而过表达Dicer上调miRNA水平则增加了m6A甲基化修饰，且在该过程中METTL3、FTO、ALKBH5的表达水平均未受影响，继而提示Dicer可通过影响miRNA的生成调节mRNA的m6A修饰水平。

2 m6A甲基化修饰与髓系造血调控

2.1 m6A甲基化修饰调控造血干/祖细胞的分化

造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs）是一类具有长期自我更新能力和分化潜能的多能干细胞。HSPCs分化出的成熟血细胞包括髓系和淋系两大类，前者包括粒系细胞、红系细胞、单核系细胞以及巨核系细胞，后者包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK cell，NK细胞）[19]。机体的造血过程起始于胚胎发育早期，其间受到严格调控，一旦在造血过程中出现了基因突变、染色体易位等遗传学改变使HSPCs分化受阻或增生异常，均会导致血液系统肿瘤的发生[20]。脊椎动物的HSPCs由生血内皮（hemogenic endothelial，HE）细胞经过内皮-造血转化（endothelial-tohematopoietic transition，EHT）过程产生[21]。Zhang等[22]在斑马鱼的血液及血管组织中发现，m6A可通过YTHDF2介导notch1a mRNA的降解，影响EHT过程中HE细胞基因表达的平衡而调控HSPCs的分化过程；该研究还发现，mettl3 缺失可通过降低notch1a mRNA的m6A甲基化修饰水平来抑制EHT过程，从而阻碍HSPCs的生成。此外，在敲低Mettl3 的小鼠模型中亦出现类似表型[23]。上述研究均提示，m6A甲基化修饰与HE细胞基因表达的平衡调控密切相关。

2.2 m6A甲基化修饰调控骨髓间充质干细胞的分化

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是存在于骨髓中不同于HSPCs的另一类干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，可在不同的诱导条件下分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞[24]。Yao等[25]研究发现，METTL3以m6A甲基化依赖性方式调节BMSCs中Janus激酶1（Janus kinase 1，JAK1）的表达，而YTHDF2则通过调节JAK1基因mRNA的稳定性影响JAK1的表达水平；同时该研究提出，降低BMSCs中JAK1基因mRNA的m6A水平可通过调控Janus激酶1/信号转导及转录激活因子5/CCAAT启动子/增强子结合蛋白β（Janus kinase 1/signal transducer and activator of transcription 5/the promoter of CCAAT/enhancer binding proteinβ，JAK1/STAT5/C/EBPβ）信号途径促进BMSCs向脂肪细胞分化。BMSCs是造血微环境中的多潜能基质细胞，参与调节骨髓造血微环境稳态，其可通过合成和分泌多种造血因子促进HSPCs的自我更新、增殖及分化，进而维持造血过程的平衡。成骨细胞具有维持HSPCs活性的能力，亦参与维持机体正常的造血功能。在Wu等[15]构建的Mettl3基因敲除的小鼠模型中，小鼠骨骼出现骨质疏松症的相关病理表型，提示Mettl3介导的m6A甲基化修饰在调节BMSCs分化过程中发挥了一定作用；该研究还发现，甲状旁腺激素/甲状旁腺激素受体-1（parathyroid hormone/parathyroid hormone receptor-1，PTH/PTH1R）是m6A的下游信号通路，且Mettl3缺失仅在翻译水平上抑制PTH1R的表达，继而表明m6A可通过调节PTH/PTH1R信号途径影响BMSCs的成骨和成脂分化过程。

2.3 m6A甲基化修饰调控细胞重编程

细胞重编程是终末分化的细胞在特定条件下逆转为原始多能或全能干细胞的过程，而诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）则是指体细胞在转入八聚体结合转录因子4（octamer-binding transcription factor 4，Oct4）、SRY 盒 式 蛋 白 2（SYR-box 2，Sox2）、v-myc鸟类骨髓细胞瘤病毒原癌基因同源蛋白（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc）及Kruppel样因子4（Kruppel-like factor 4，Klf4）共4种转录因子后，被转化为具有胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）特征的细胞[26]。Chen等[16]研究显示，在表达4种多能性因子Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4的小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）中过表达Mettl3可使m6A水平升高，且Mettl3过表达的MEF细胞中OCT4、SOX2、NANOG同源框蛋白多能性因子表达增加，这提示m6A可调控体细胞内多能性因子的表达水平，从而促进体细胞重编程为多能干细胞。c-MYC是正常造血细胞和白血病细胞自我更新与分化的主要调节因子，METTL3亦可通过增加c-Myc基因mRNA的m6A修饰水平提高白血病细胞中c-MYC蛋白的表达量[27-28]，进而抑制细胞分化并促进白血病细胞的自我更新，发挥在血液肿瘤中的致癌作用。

3 m6A甲基化修饰与血液系统恶性肿瘤

3.1 m6A甲基化修饰在急性髓系白血病中的作用

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种具有高度异质性的HSPCs恶性克隆性增生的髓系肿瘤，是最为常见的成人急性白血病类型。白血病细胞以自我更新增强、增殖失控、分化受阻和凋亡受抑为特征，在骨髓中增殖累积导致正常造血细胞减少。在分子水平上，AML的发生遵循“多次打击”的模式[1]。m6A相关组分失调可诱导癌基因表达，促进恶性肿瘤的发生[28-29]，并通过加强AML细胞的自我更新能力在AML进展中发挥重要作用。Vu等[27]研究发现，METTL3在AML细胞中呈高表达，并可介导m6A甲基化修饰促进AML细胞增殖、抑制细胞分化，在AML中发挥致癌作用；下调METTL3基因则可通过升高蛋白激酶B（phosphate protein kinase B，PKB/AKT）的磷酸化水平诱导AML细胞分化及凋亡，而对于正常造血细胞的凋亡无诱导作用；同时该研究还发现，m6A修饰可通过提高AML细胞中c-MYC、B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，BCL2）基因和第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）基因mRNA的翻译水平发挥致癌作用，从而进一步说明METTL3可作为髓系恶性肿瘤的致癌因子，对临床治疗具有重要的参考价值。METTL14为m6A甲基转移酶复合物的另一重要组分，Weng等[30]研究表明，METTL14在AML细胞中亦呈高表达，可通过介导m6A甲基化修饰阻断正常髓系细胞的分化、促进恶性造血，在正常骨髓生成与AML的发病机制中均发挥关键作用。以METTL3与METTL14为代表的m6A相关因子异常可能是血液系统肿瘤发生的潜在因素，这为其临床诊疗提供了新的方向。

3.2 m6A甲基化修饰在骨髓增生异常综合征中的作用

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一组以骨髓造血细胞发育异常、病态造血以及外周血细胞计数减少为特征的恶性克隆性疾病，且具有较高的向白血病转化的风险[2]。细胞的发育过程包括细胞增殖与分化，而由MDS引起的骨髓造血细胞发育异常表现为在MDS早期即呈现出细胞分化障碍和过度凋亡，且在疾病进展时异常细胞表现出凋亡抵抗[31]。目前的研究普遍认为，MDS的发生与发展是多个基因事件的累积损伤，且基因组异常与表观遗传修饰改变的共同作用可引起MDS的表型异质性[2]，其中相关基因的表达水平改变可能影响MDS骨髓造血细胞中的关键癌基因或抑癌基因，使得异常造血细胞获得克隆性增殖优势。既往研究[32]表明，RNA剪接体编码基因可能作为早期驱动基因参与MDS的发生与发展过程。剪接体的微小改变可影响剪接的特异性，引起转录蛋白多肽序列的改变，进而影响造血细胞的正常生理功能，但迄今为止由异常RNA剪接所诱发MDS的确切机制尚不清楚。YTHDC1定位于细胞核，可通过募集前体mRNA剪接因子介导mRNA的剪接过程[33]，这有助于阐明剪接异常在MDS异常造血功能中的作用。另外，下调METTL3基因所引起的m6A修饰水平降低可改变前体mRNA选择性剪接（alternative splicing，AS）模式，而该过程主要富集于p53信号通路和细胞凋亡通路中[13-14]。因此，上述结果进一步说明m6A甲基化修饰对于MDS异常剪接机制的探索具有重要意义。

基于m6A的骨髓造血调控功能，对于维持骨髓正常的造血过程具有重要作用。骨髓是机体造血的主要场所，骨髓造血功能的调控异常可导致一系列疾病的发生。遗传性骨髓衰竭综合征（inherited bone marrow failure syndromes，IBMFS）是一组异质性遗传性疾病，以骨髓造血功能衰竭、先天性畸形以及向恶性肿瘤进展的风险高为共同临床特征[34]，主要包括范可尼贫血（Fanconi anemia，FA）、先天性角化不良（dyskeratosis congenita，DC）、戴 - 布二氏贫血（Diamond-Blackfan anemia，DBA）和舒 - 戴二氏综合征（Shwachman-Diamond syndrome，SDS）等，其中FA是由于DNA修复机制缺陷所致，而DC则是由端粒酶缺陷引起，二者均具有获得基因改变并发展为MDS的倾向。IBMFS的血液系统病变表现为骨髓造血功能受损、全血细胞或单系细胞减少，这提示IBMFS病变是来源于髓系多能干细胞水平。m6A及其相关因子可通过显著影响骨髓造血发育参与IBMFS的发生与发展过程，但其确切作用机制尚待进一步研究阐明。

3.3 m6A甲基化修饰与血液系统恶性肿瘤的治疗

血液系统恶性肿瘤的发生与发展是多步骤的病态过程，由于肿瘤存在缓解率较低、复发率较高以及复发后难治等问题，患者通常预后不良。传统化学治疗（化疗）方案耐药发生率较高，是血液肿瘤患者难治复发的根源之一，而采用多种疗法的联合使用则可提高临床疗效。程序性死亡受体 -1（programmed death-1，PD-1）作为免疫检查点广泛表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和多种肿瘤细胞表面，与细胞凋亡密切相关。程序性死亡配体 -1（programmed death ligand-1，PD-L1）是 PD-1的主要配体，二者结合后可从多个层面抑制机体的抗肿瘤免疫应答。针对PD-1/PD-L1位点的免疫治疗已应用于多种恶性肿瘤，通过阻断PD-1/PD-L1信号途径可改善机体的免疫抑制状态，增强抗肿瘤免疫应答[35]。去甲基化药物，如DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）抑制剂地西他滨与阿扎胞苷，目前已广泛应用于临床，研究[36]结果显示该2种药物通过上调AML与MDS患者PD-1、PD-L1的表达水平介导AML与MDS耐药，从而提示PD-1/PD-L1抑制剂可提高髓系恶性肿瘤患者对去甲基化药物的敏感性。Han等[37]的报道指出Ythdf1缺陷型（Ythdf1-/-）小鼠相较于野生型小鼠表现出更强的抗肿瘤免疫应答，而阻断PD-L1亦可促进Ythdf1-/-小鼠的抗肿瘤免疫应答反应，从而揭示了m6A相关蛋白抑制剂与免疫疗法的联合使用在血液系统恶性疾病的治疗中具有广阔的应用前景。

Li等[38]研究表明，FTO在AML中起着致癌作用，其作为去甲基化酶可通过降低m6A修饰水平促使AML的发生，并抑制全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）诱导下的异常克隆向正常造血细胞分化。Huang等[39]研究显示，FTO抑制剂在体外可显著抑制AML细胞增殖并促进AML细胞分化和凋亡，因而靶向抑制FTO有望成为治疗AML的新策略。另外，针对m6A甲基转移酶关键组分METTL3与METTL14的靶向治疗，有助于提高血液系统恶性疾病化疗药物的敏感性。阻断METTL3活性的小分子抑制剂联合FMS- 样酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3，FLT3）和异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）2 种化学抑制剂可能是治疗髓系恶性肿瘤的一种新方法[27]；靶向METTL14的小分子抑制剂联合标准分化诱导剂，可增强白血病患者的化疗敏感性[30]。目前，异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是多种血液系统恶性肿瘤的有效治疗方式[40]，但allo-HSCT往往伴随一系列的治疗并发症，其中移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）是allo-HSCT患者的主要并发症，亦是引起患者非复发死亡的主要原因。近年来的研究[41]显示，BMSCs是防治GVHD的有效方法，且BMSCs联合造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的移植可促进移植后患者的造血恢复。因此，基于m6A修饰相关的多能干细胞分子调控机制的进一步研究，或将为血液系统恶性疾病患者提供更多的可移植干细胞带来福音。

4 总结与展望

m6A修饰是真核生物RNA中广泛存在的一种甲基化修饰方式，m6A及其相关因子对恶性肿瘤影响的相关研究是RNA表观遗传学研究的热点，但目前m6A相关蛋白种类和功能的研究仍处于探索阶段。基于上述的研究发现，m6A甲基化修饰能够影响血液系统恶性肿瘤多能干细胞的自我更新、增殖以及分化过程，但其在正常造血及恶性血液病中确切的生物学功能尚不明确。同时，关于m6A甲基化修饰调控造血系统以及诱发血液肿瘤的分子机制尚需进一步阐明，这对于深入认识血液系统恶性肿瘤的致病机制、探索新的靶向干预具有重要意义。