microRNA Let-7对急性缺血性卒中的作用

耿路，廖慧玲

(西南医科大学，四川 泸州)

0 引言

急性缺血性卒中是指多种原因导致脑的供血动脉狭窄甚至闭塞，使得局部脑组织血供突然减少或停止，脑组织缺血、缺氧致组织坏死或软化的急性脑血管疾病，是临床上常见病及多发病，常伴有不同程度的神经功能缺损，具有较高发病率、死亡率及致残率，严重威胁人类生命健康[1-2]。目前其治疗手段主要有溶栓、抗凝、减轻氧化应激损伤，保护神经细胞、神经功能康复训练等[3-4]。与常见心血管疾病不同，急性脑梗死主要通过临床症状及影像学资料等作出临床诊断，缺乏快速有效的临床诊断血清学指标及治疗手段。因此，寻找更为精准、便捷、高效的诊断工具及新的治疗方法对提高急性缺血性卒中患者生存率及改善预后具有重要意义。微小RNA(microRNA ，miRNA)是一类单链的小分子非编码RNA，约含有17～25个核苷酸，负调控转录水平后基因的翻译[5]。miRNA作为一种重要的基因水平调控因子，近年来在缺血性脑卒中深入研究中表现出极大的优势。let-7家族是人体内最先被发现的miRNA，目前研究已较为成熟。在哺乳动物体内，目前发现的let-7家族约有13个亚型[6]，在人体内异常表达与人类疾病如癌症和心脑血管疾病密切相关。在不同脑组织let-7表达有所差异，研究证实[7]let-7家族在大脑海马区高度表达表现出明显的组织特异性，这可能是海马区缺血易感性的原因之一。既往研究发现let-7在脑血管疾病诊断、治疗及发病机制中发挥重要作用，本文通过查阅近五年let-7与脑梗塞关系相关文献，对let-7在脑缺血中作用进行综述，以便寻找新的诊断、治疗手段及治疗靶点。

1 脑缺血中Let-7的作用

急性缺血性卒中病理生理过程复杂，其中涉及级联损伤反应以炎症及细胞凋亡相关的级联反应为主。目前认为其病理损伤机制主要是炎性反应、氧化应激损伤、神经元凋亡及血管新生过程中多种通路复杂交互的作用。在此过程中多种蛋白差异性表达，参与级联损伤机制，现发现miRNA能与40%-50%哺乳动物的mRNA结合进行转录后水平调控而影响mRNA翻译编码蛋白。因此miRNA可能参与整个脑缺血发生过程中。许多研究已证实let-7对脑缺血有明确作用。

1.1 Let-7与炎性损伤

大量研究结果证实炎症反应贯穿整个卒中发生发展过程，炎性因子的释放影响继发性脑损伤及恢复的过程[8]。白介素-6(IL-6)作为中枢性炎症反应早期的重要调控分子，在脑组织缺血缺氧后超量释放的活性氧刺激下表达上调，进一步激活炎性细胞因子，招募更多炎症细胞聚集浸润，损伤脑组织。其具体分子机制可能是IL-6靶向调控NF-κB转录因子促进iNOS的表达，增加NO生成，加重大脑氧化应激损伤[9]。此外IL-6可激活其下游分子STAT3，刺激ROS产生，进一步增加IL-6的产生加快局灶性脑缺血的梗死进程，加重缺血再灌注损伤。有学者[10]通过临床研究发现Let-7f在无出血性转化(HT)的急性脑梗死患者中的水平降低，且抑制IL-6的表达，说明Let-7f可抑制IL-6的表达而减轻急性脑梗死患者炎症。此外，在该项研究中脑梗塞合并HT患者的Let-7f表达水平明显增加，这提示Let-7f可能对HT发挥某种作用，然而其具体调控机制尚待进一步研究。

有研究表明let-7a在脑缺血再灌注后脑组织中表达显著上调，参与调控炎症反应及细胞凋亡，进一步损伤神经元[11]。胡国章等[12]结合生物信息学方法，通过敲除小鼠let-7a表达发现let-7a靶向结合丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1 (MKP1)抑制其转录后水平表达，减少炎症介质TNF-α和IL-6等的释放，减轻脑缺血再灌注后炎症反应和细胞凋亡，发挥神经保护作用。

小胶质细胞是脑组织中广泛存在的巨噬细胞，在脑缺血过程中发挥免疫监控及加重损伤神经元的作用[13]，研究发现脑缺血损伤反应迅速激活小胶质细胞，促进大量炎性介质(如iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6等)表达，超量释放NO和活性氧等有害物质，不可逆的损害神经元及周围神经细胞[14]。故抑制脑缺血后小胶质细胞激活不失为一种保护缺血脑神经损伤新的治疗方法。倪敬书等[15]通过体内、外实验研究表明let-7c在中风患者及脑缺血再灌注小鼠血浆中表达降低，过表达let-7c可抑制小胶质细胞激活，从而抑制脑缺血后炎性反应，减轻脑缺血神经元损伤及改善缺血后神经功能缺陷。

巨噬细胞在人体的功能集中于全身炎症的诱导、消退及组织修复[16]，对脑缺血组织病理损伤及预后恢复具有重要意义。有研究证明let-7c 可通过调控巨噬细胞极化缓解慢性炎症[17]。巨噬细胞的极化机制复杂，受多种信号分子及其通路的调控，在不同环境的刺激下巨噬细胞可极化为经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代性活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)，两者功能几乎相互拮抗[18]。Banerjee等[19]发现过表达let-7c显著促进 M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，抑制M1表型基因的表达，减少多种炎症因子如iNOS，TNF-α和IL-6等释放，从而减轻炎性反应。

CD86由活化的单核细胞和B细胞表达，促进中风后白细胞增殖与募集，刺激多种炎性介质如IL -6，TNF-α，CCL2，TNFSF11等的产生，加重脑损伤。白细胞介素-8(CXCL8，IL-8)是由活化的巨噬细胞和内皮细胞产生的趋化因子，其调控可能是限制缺血性脑损伤必不可少的。能够结合CXCR1和CXCR2来促进中性粒细胞趋化性，增加MMP9释放，促进脑组织损伤，加重脑梗塞程度。HMGB1由脑细胞及包括白细胞在内的大多数细胞产生，主要介导损伤组织先天免疫和修复，促进白细胞增殖和趋化至损伤部位，与免疫炎性反应密切相关。Jickling等[20]通过研究急性缺血性中风患者let-7i调控白细胞的作用，发现let-7i负调控CD86从而抑制中风后炎症细胞活化及炎性因子释放，减少梗死面积，减轻脑损伤并改善行为预后。Let-7i可能会增加IL-8，促进与中风严重性相关的嗜中性粒细胞活化，损伤脑组织，加重脑梗死程度。Let-7i减少可能使缺血性中风患者的HMGB1增加，中性粒细胞增生，诱导MMP9释放，进一步加重炎性反应。因此let-7i通过靶向调控CD86，CXCL8和HMGB1这三种途径调节中风后炎症反应。

之前已证实Toll样受体4(TLR4)参与急性缺血性卒中炎症病理机制，有大量的研究报道let-7i通过靶向调控其下游分子TLR4基因及蛋白表达参与多种疾病的发病机制。向伟等[21]在建立缺氧糖剥夺模型的基础上证明let-7i下调 TLR4 的表达，降低MMP9和iNOS的含量，由此减轻模型中人脑微血管内皮细胞的炎性损伤。这可能是let-7i调控急性缺血性卒中过程的作用机制，但还需要大量临床资料支撑及分子实验研究证明。

1.2 let-7与细胞凋亡

脑缺血半暗带损伤是决定缺血性卒中患者严重程度及预后的主要因素，而神经细胞凋亡是此区发生的主要病理改变，属于迟发性病变。且脑缺血后调节凋亡的miRNAs的水平变化与这种现象一致。研究表明脑缺血患者血清let-7 家族成员let-7e 和miR-98一致性下调，可能通过调节与细胞凋亡相关基因表达而导致缺血区细胞凋亡，进一步诱导脑缺血损伤[22]。

Caspase-3是脑缺血再灌注损伤时介导神经元凋亡的关键执行因子[23]，有学者发现全脑缺血再灌注后30min和24h海马区的let-7a/7b/7c/7d/7e/7f/miR-98表达均下调，而一些有害蛋白如Caspase-3表达明显增高且持续较长时间。袁圆通过体外诱导细胞损伤模型研究发现let-7e可能通过下调促凋亡基因Caspase-3mRNA和蛋白表达，而发挥抑制细胞凋亡，保护神经细胞功能的作用[24]。虽已有研究者用生物学实验证实了Caspase-3是let-7a的作用靶点，但其具体作用暂不明确。let-7家族中其他成员是否能靶向调控Caspase-3表达影响神经细胞凋亡还待验证。

Fas配体、TNF受体作为TNF超家族成员调节全脑缺血后的神经元凋亡。有学者发现短暂脑缺血再灌注后Fas配体、TNF受体明显上升，且查询生物信息学数据库我们发现Fas配体、TNF受体可能是let-7家族的靶基因，因此提出脑缺血后let-7家族表达下调，可能使与细胞凋亡有关的因子、配体和受体表达增高，导致神经元受损加重这一合理假设，具体调控机制还需进一步深入研究证实。

1.3 let-7与血管内皮功能及血栓形成

血管内皮损伤及血栓形成是急性脑梗死的重要病理基础，不仅增加脑梗死发生机率，且使其加重。研究表明let-7f在血管内皮中发挥重要调控作用[25]。低表达let-7f激活蛋白依赖性激酶，促进内皮细胞增殖分化，使血管内壁增厚，管腔狭窄，脑组织血供减少，诱导脑梗死发生；此外下调let-7f损伤血管内皮细胞结构，大量胶原组织暴露，刺激组织因子释放，血小板聚集增加，血液流动性降低，凝血反应链被激活，促进脑动脉血栓形成；let-7f减少可介导细胞定向转移和趋化性，并激活内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞相应的趋化因子受体，促进高凝和纤溶亢进，，增加血液黏滞度，促进血栓形成，最终诱发急性脑梗死[26]。let-7f可减少细胞基质金属蛋白酶的分泌，抑制细胞外基质的降解，保护血管内皮之间紧密结构，进一步维持血脑屏障稳定。

动脉粥样硬化(AS)是脑动脉血栓形成的主要病理基础之一，也是脑卒中的重要危险因素，抑制AS形成，对防治脑卒中具有积极作用。目前广泛认为慢性炎症是其形成的关键环节[27]。炎症标志物IL-6释放可激活体内补体及凝血机制，诱导活性因子如组胺、氧自由基及兴奋性氨基酸等释放，引起机体微循环障碍，使血液高凝，促进血栓形成，参与急性脑梗死疾病过程[28]；而let-7f下调炎症标志物IL-6表达，抑制动脉粥样斑块形成，维持其稳定性，从而调控脑梗塞发生发展。功能学研究表明，let-7e能调节TLR4的表达从而影响血管内皮细胞的敏感性和耐受性[29]，但具体调控机制尚不明确。且在脑卒中急性期，血小板破坏或消耗增加，刺激骨髓巨核细胞增生和新生血小板生成，而let-7e可能参与血小板的生成及活化，影响血栓形成，其具体调控机制尚不清楚。Slava等[30]在体外和体内实验中发现let-7g和miR-98靶向抑制炎症分子CCL2和CCL5分泌，减少内皮细胞与炎性细胞之间的黏附及内皮细胞迁移，促进细胞与基质紧密连接，减少炎性渗漏，保护血脑屏障及细胞内皮功能。Liao等[31]发现Let-7g可通过TGF-β途径抑制THBS1，TGFBR1和SMAD2炎症相关基因表达，减少内皮细胞炎症和单核细胞粘附，抑制血管内膜增生，保护内皮功能。此外，Let-7g通过增加SIRT-1表达保护内皮正常功能，下调PAI-1的表 达减少巨噬细胞浸润益于维持内皮稳态。

1.4 Let-7与神经再生及血管生成

脑缺血后神经元及新血管的生成，有利于增加缺血脑组织血供，神经功能恢复，与脑梗塞患者疾病严重程度、预后及并发症相关联。在大鼠短暂性大脑中动脉闭塞再灌注模型中，使用芯片分析和qPCR技术首次发现48小时再通后脑组织中与神经细胞分化相关的let-7明显上调。既往研究中发现let-7i的表达缺失可以抑制神经的再生，还可通过转录后调节参与神经元的分化及凋亡，具有潜在的神经保护作用[32]。

人们最早通过Dicer和Drosha敲除法发现let-7家族在内皮细胞中高度表达，let-7f可通过靶向抗血管生成基因促进血管生成，成为调节血管生成有力的靶点。其中let-7f下调可明显抑制新生血管形成，其主要调控机制是影响血小板反应蛋白、Nrp-2、TIMP-1、TEK、Tie-1、VEGFR2等血管生成相关的因子的表达[33]。NDRG3是人体内一种氧调节蛋白，缺氧条件下体内堆积的大量乳酸与之结合抑制其降解，同时激活低氧诱导的Raf-ERK途径，促进新生血管形成和神经细胞再生。姚要兵等[34]通过临床研究发现let-7f负调控NDRG3基因及蛋白表达参与血管及细胞再生。

2 Let-7作为脑缺血的血清学指标

临床上采集血清标本检测血清学指标可协助快速诊断疾病，了解治疗效果及评估患者的预后。在MCAO模型大鼠缺血再灌注24h及 48h后均可检测到脑内和血液中let-7水平变化。Let-7具有miRNA高度保守的特性，在血浆中稳定表达，且其在血液中的水平随疾病发生逐渐变化，这说明血浆中let-7水平高低可以反应疾病的不同阶段。研究发现[35]急性脑梗死患者体内血清let-7f表达水平变化明显，且能轻易通过损伤血脑屏障及细胞膜，稳定存在于血液中，与脑梗死梗死灶面积的大小、严重程度及神经功能缺损程度呈正相关，可作为临床辅助诊断急性脑梗死的血清学指标。此外有研究证明let-7f早期联合IL-6检测能特异性诊断急性脑梗死，具有较高的灵敏度，值得临床推广和应用。彭国平等[36]在脑梗患者发现let-7e表达的特异性高达73.4%和敏感性达82.8%。其表达水平在急性期最高，随着病程延长而逐渐下降，在慢性期最低，提示let-7e可作为判定急性脑卒中潜在的生物学标志物，尤其急性期临床价值更大，对预测脑梗死的预后方面也有重要意义[37]。黄志军等[38]通过检测脑梗塞患者与正常健康人外周血miRNA的差异表达，也发现脑梗塞患者外周血浆let-7b明显上调，可能是急性脑梗塞潜在的分子生物学标志物。

3 总结与展望

Let-7在急性缺血性卒中诊断中的应用虽已有相关文献报道，但let-7作为卒中生物学标志物的灵敏度及特异性标准不一，目前研究还存在诸多不足，尚无一种得到国内外学者公认可以应用于临床脑梗塞的诊断和预后评估[39]。此外miRNA应用于临床治疗仍存在很大争议。Let-7除了能够调节靶基因转录后水平表达外，同时也受其他物质调控，形成相应的生物反馈机制，目前其用于临床治疗的研究大多关于miRNA类似物、抑制剂的使用，但miRNA与目标基因并非一对一调控的关系，在发挥治疗作用的同时，同时也可能产生或多或少的副作用。但也因miRNA这种多靶点调控的特点，为疾病发病机制研究打开一扇新的大门。目前Let-7在脑血管疾病作用的研究尚处于起步阶段，无论是在基础研究还是临床诊断治疗、预后及药物开发中均大的潜力和价值，且let-7具有明显的组织特异性，在不同脑组织、血液甚至其他体液中表达均有明显差异，今后有必要对不同脑组织中let-7家族在生理及病理情况下的表达变化作进一步深入研究，有助于揭示脑缺血组织分子生物学特性，进行筛选及定位，为进一步深入研究其调控机制奠定基础，也为脑梗塞治疗提供载体或靶点，可能成为无数脑梗塞患者的福音。