固定化漆酶去除废水中双酚A

孙凯 陈正杰 汪登洋 束茹玉 吴吉 韦凡

（农田生态保育与污染防控安徽省重点实验室 安徽农业大学资源与环境学院，合肥 230036）

内分泌干扰物（Endocrine disrupting chemicals，EDCs）是一类可以破坏生物体正常生长、发育和繁殖的新兴污染物，其在低浓度条件下能够对人群健康和生态安全造成威胁［1-2］。双酚A（Bisphenol A，BPA）是生态环境中最常见的有机污染物之一，该化合物主要用于合成聚碳酸酯和环氧树脂塑料［3］。目前，美国环境环保局已经将BPA列为EDCs，主要是因为它能够干扰生物体内天然激素的正常生产、分泌、运输和代谢等过程［4］。研究指出，浓度范围在4.38-43.8 μmol/L的BPA能够对水生生物产生急性毒性，而当每立方米水体中BPA浓度低于1 μg时，其即可以表现出雌激素活性［5］。废水中BPA的去除方法主要包括物理化学吸附［6］、芬顿氧化［7］、光催化［8］、臭氧氧化［9］、电化学降解［10］和生物膜过滤［11］等。这些技术已经用于处理工业废水和城市污水中BPA，但它们具有明显的缺陷，如价格高昂、耗时、副产物毒性高及对环境造成二次污染等。

已有报道指出，微生物酶如锰过氧化酶［12］、辣根过氧化物酶［13］、多酚氧化酶［14］和酪氨酸酶［15］等，具有高度专一性，有望彻底消除环境中微量浓度BPA引发的动物和人群健康风险。漆酶（Laccase，EC 1.10.3.2）属于一类蓝色胞外含铜多酚氧化酶，广泛分布于白腐真菌中［16］。该类酶具有催化效率高、底物广谱和生态可持续等优点，已经在食品加工、纺织染色、纸浆漂白、染料脱色、环境监测和生物修复等领域得到普遍应用［17-18］。尽管如此，游离态漆酶的活性和稳定性容易受到诸多环境因素的干扰，如pH、温度、金属离子和天然有机质等，从而限制了其在BPA污染废水中的有效应用［19］。近年来，固定化技术的快速发展对漆酶在BPA污水处理中的大规模应用具有重要的战略意义［20］。本文总结了生态环境中BPA的潜在来源及其对生物体健康的危害，重点阐述了固定化漆酶对废水中BPA的降解效能和作用机制，评估了酶促反应体系中BPA转化副产物的雌激素活性和生物毒性，旨为大规模应用固定化漆酶去除废水中BPA奠定理论基础和提供技术指导。

1 环境中BPA的主要来源和危害

BPA作为全球需求量增长最快的有机化工原料之一，主要用于制造黏合剂、聚碳酸酯、环氧树脂涂料、聚氯乙烯热稳定剂和增塑料等［3］。由于BPA在工业领域的大量生产和广泛应用，导致其不可避免的对野生生物和人类健康构成威胁［5，21-22］。环境中的BPA主要来源于造纸厂和化工厂的废物排放、城市污水处理厂的不完全去除、垃圾填埋场的渗滤液外泄和复合塑料的生物化学降解等（图1）。BPA能够通过空气、水源和食物等多种途径进入野生生物体内，特别是通过食物链的传递被人体吸收和摄取，从而引发人群健康风险［23-24］。目前，研究者在人体尿液、血清、唾液、羊水和胎盘组织中持续检测出BPA表明，人类长期暴露于BPA污染环境中［25］。例如，Song等［26］调查了垃圾场周边老年居民血清中BPA含量，其检测率高达65%以上，平均浓度为14.0 nmol/L。

图1 BPA的主要来源及其对生物体的健康危害

图1总结了BPA对生物体造成的主要健康危害。该类污染物进入动物和人体内，可以模拟细胞内天然雌激素的作用机理，干扰有机体内天然激素的正常合成、释放和代谢等过程，即使其在微量浓度也会对生物体造成毒害效应。例如，环境浓度下的BPA可导致斑马鱼的胚胎出现心包水肿、卵黄囊肿、脊柱弯曲和尾部弯曲等症状［27］；而小鼠暴露在BPA中会显著地影响其后代的性别比例，导致幼鼠的雌性化［28］。另有研究指出，BPA能够影响孕妇分娩过程，导致新生儿DNA甲基化，从而改变出生婴儿的某些特定基因表达［29］；BPA对男性的影响则是降低其精子的数量和质量［30］。此外，人体接触过量的BPA也可能引发心血管疾病和糖尿病等症状［31］。因此，亟需采用有效手段消除环境中的BPA污染风险。目前，废水处理厂主要采用物理化学和生物处理技术去除废水中BPA，但是其对低浓度的BPA转化效率有限［6-10，32］。如何构建新型、高效、绿色、环保的BPA处理方法已经成为环境工作者需要迫切解决的重点难题之一。

2 真菌漆酶介导BPA的去除和转化

漆酶是一种绿色催化剂，普遍存在于细菌、真菌、高等植物和昆虫体内［33］。报道表明，漆酶具有反应条件温和、催化效率高、底物广谱和经济环保等优点，已经被广泛应用于催化氧化芳香族、脂肪烃、酚类和苯胺类等化合物［16，18，34］。目前，漆酶在工业领域的大规模应用主要受限于其分离纯化成本较高［19-20］。因此，筛选纯化出高产漆酶真菌，并直接利用其胞外分泌的粗漆酶催化降解环境中的BPA备受瞩目［14］。同时，采用天然或人工合成的氧化还原介质作为漆酶和污染物之间的电子穿梭体，可有效增强漆酶对难降解有机污染物的去除效率［35-36］。值得注意的是，天然介质存在于漆酶粗提取物中，而纯化的漆酶需要掺入人工合成介质才能明显提高它的催化效能［19，37］。表1总结了不同来源的真菌漆酶对水体中BPA的去除效率及其生成的主要中间产物。例如，Daâssi等［38］指出毛革孔菌（Coriolopsis gallica）漆酶-羟基苯并三唑（HBT）介质体系在4 h内对BPA的降解率高达100%。然而，人工合成介质可能对生态环境造成二次破坏，这促使研究者开发天然介质以规避环境二次污染、提高漆酶的催化效能。例如，de Freitas等［36］研发了一种高效、经济、安全、环保的生物处理技术，该技术利用糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）漆酶及其粗漆酶液中的天然介质构建复合反应体系，结果发现它们在1 h内对废水中浓度为0.44和0.88 mmol/L的BPA去除率分别高达100%和85%。本课题组研究指出，变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶在25℃、pH 5.0时对5 μmol/L的BPA降解半衰期为70.7 min。这些结果表明，添加氧化还原介质可以显著促进漆酶催化BPA的转化，其中天然介体比人工介质更具有成本效益和生态可持续性。

表1 真菌漆酶催化氧化BPA的去除效率及其主要中间产物

真菌漆酶催化BPA的转化中间产物包括大分子聚合产物和小分子氧化分解产物，其主要受到漆酶来源和介质种类的影响（表1）。一方面，漆酶能够催化BPA形成苯氧自由基中间体，随后这些活性中间体在酶促反应位点外发生共价耦合，形成BPA二聚体、三聚体、四聚体、低聚物和高聚物［45-46］。聚合产物的形成显著地降低了母体化合物的雌激素活性和生物毒性，可以通过后续的沉淀或过滤工艺去除［46-47］。另一方面，在漆酶-介质反应体系中，介质起到电子穿梭体的作用，促使漆酶催化氧化BPA的C-C键裂解，随后形成多种小分子氧化分解产物［35，38］。例 如，研 究 者 在 糙 皮 侧 耳（Pleurotus ostreatus）粗漆酶（含天然介质）催化的BPA反应体系中，共检测到13种BPA的芳香族和脂肪族代谢产物，主要包括4-异丙基苯酚、甲基戊-3-酸和4-乙基-2-甲氧基苯酚等，其中某些产物具有与BPA类似的生物毒性效应［36］。图2列举了真菌漆酶介导BPA发生自由基耦合和氧化降解反应的两种主要转化途径。不同来源的真菌漆酶，其氧化还原电位各不相同（0.4-0.8 V），这些差异显著地改变了BPA转化中间产物的形成及其相对含量［48］。需强调，游离态漆酶的催化活性易受环境pH、温度、有机分子和无机颗粒等多种因素的影响，难以分离纯化和循环再利用，从而限制了其在废水处理中的实际应用。研究表明，固定化酶技术有助于漆酶的回收再利用，并可显著地增加漆酶的稳定性和催化效能［49］。因此，该技术不仅有望实现漆酶对BPA的连续降解，也可以提高漆酶对BPA的去除效率，从而为大规模利用漆酶彻底去除废水中BPA提供重要依据。

3 固定化漆酶在BPA去除中的应用

目前，学者们主要通过降低生产成本、提高稳定性和实现回收利用等途径来研究固定化漆酶在废水处理中的应用，其中载体的选择对漆酶催化效能和稳定性起到关键作用［16，50-51］。固定化漆酶的载体主要包括纳米材料（如纳米ZnO、MnO2和氧化石墨烯）［52-53］、磁性颗粒（如磁性纳米Fe3O4和纳米花）［54-55］、多孔材料（如活性炭和沸石）［56-57］和高分子材料（如壳聚糖和海藻酸钠水凝胶）［14，58］等。一方面，载体的比表面积越大，其对漆酶的固载量越高［59］；另一方面，载体的传质阻力越小，漆酶分子越容易固定在载体孔道内部［60］。因此，选择比表面积大和传质阻力小的载体，不仅有助于在载体表面引入功能基团（如羟基、羧基和氨基），也可以使BPA更易接触漆酶的活性位点并加速产物从孔道中的释放。常用的固定化技术包括物理和化学法，其中物理方法有吸附法和包埋法，化学方法有共价结合法和交联法［16，61］。由此可见，通过优选固定化载体和改进固定化方法，有助于提高酶促反应的稳定性、催化效能和可操作空间，从而为大规模利用固定化漆酶处理BPA污染废水提供有效的参考价值。

图2 真菌漆酶催化BPA的自由基耦合和氧化分解途径

3.1 纳米材料固定漆酶对BPA的去除作用

近年来，基于纳米材料的生物酶固定化技术普遍引起研究者关注。纳米金属载体具有比表面积大、性能稳定和可重复使用等特性，这些优点不仅有利于增加漆酶催化活性位点与底物分子的结合，也为漆酶提供了一种生物兼容性和惰性环境［62-63］。例如，Rani等［52］将Cu2+螯合在纳米ZnO（＜ 50 nm）和MnO2（＜ 10 nm）颗粒表面，并通过金属亲和吸附作用将变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶固定在两种金属纳米粒子上。该方法显著增强了漆酶的环境稳定性、催化活性及其对废水中有机污染物的去除效果。图3展示了漆酶在纳米金属氧化物表面的固定化操作流程及其对废水中BPA的降解机理。另有研究指出，纳米石墨烯或纳米氧化石墨烯具有较大的比表面积、丰富的功能基团和良好的生物相容性，同时也表现出优异的耐热性、耐化学性和机械稳定性，这些材料独特的理化性能可以增强底物分子与固定化漆酶之间的电子转移作用，从而促进底物的氧化降解［53，64］。例如，将漆酶固定在石墨烯或氧化石墨烯复合纳米颗粒上，不仅能够扩大漆酶的pH和温度适应范围，也提高了漆酶的可重复利用性［65-66］。这些性能的改变有效地促进了BPA与漆酶分子之间的电子传递，从而有利于废水中BPA的生物转化。此外，纳米静电纺丝纤维的高孔隙率和比表面积，也能够确保漆酶的高负载率，并降低传质阻力，可作为漆酶固定化载体并具有开发应用潜力［67］。在今后的研究中，如何设计和构建复合纳米载体，以实现固定化漆酶对废水中BPA的高效生物转化，对促进绿色可持续生态修复技术的发展具有重要的现实意义。

图3 漆酶在纳米金属氧化物表面的固定化及其对废水中BPA的去除机理

3.2 磁性颗粒固定漆酶对BPA的降解效能

据报道，磁性颗粒对漆酶的负载量较大，并可以与底物充分接触，具有良好的催化性能和易重复利用等优点［54，66］。例如，刘莉等［68］以Cu2+为桥基，通过螯合作用将漆酶固载在乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tet-raacetic acid，EDTA）功能化的磁性颗粒表面，制备固定化漆酶磁性材料。该操作工艺反应条件温和，不会破坏酶的空间结构，且能够保持酶的活性和提高蛋白的固载量。目前，研究者［61］主要通过亲和吸附、共价结合和交联法，将漆酶固定在磁性颗粒表面，其中最常用的磁性粒子为Fe3O4。磁性纳米Fe3O4比表面积大、表面羟基丰度高，易于进行表面修饰以及与漆酶分子的结合［63］。同时，纳米级磁性颗粒具有超顺磁性，可以通过添加外部磁场简单地从生物催化反应体系中分离。此外，磁性纳米颗粒的机械稳定性高、孔隙率低，这些特性有利于降低反应中的传质阻力，并提高固定化漆酶的重复使用率［66，69］。例如，欧阳科等［70］制备的磁性纳米Fe3O4/石墨烯固定化漆酶对酸的适应能力、耐热性和贮存稳定性均有所提高，该固定化漆酶在18 h内对BPA的去除率高达82.1%，且循环使用10次后仍保留80%以上的漆酶活性。图4总结了采用交联酶聚合体法制备磁性纳米Fe3O4微球固定化漆酶的工艺流程［71］，该方法在11 h内对262.7 μmol/L的BPA去除效果为87.3%。另有研究者［55］将氨基功能化的磁性纳米颗粒附着在漆酶-无机杂化纳米花上发现，该磁性纳米花在5 min内对BPA的降解率高达100%，且具有较长的保藏周期和优异的循环再利用性能。

图4 磁性交联漆酶聚合体的制备及其对BPA的去除效果［71］

3.3 多孔材料固定漆酶对BPA的转化机制

由于多孔材料如活性炭和沸石的比表面积较大，因此利用多孔材料作为漆酶固定化载体可有效提高单位体积的酶固载量和催化活性［72-73］。与多孔的有机漆酶载体相比，多孔的无机漆酶载体的理化性质较稳定，孔隙结构更容易控制，并具有良好的生物相容性［61，74］。例如，Nguyen等［56］研究指出，将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的漆酶固定在粒状活性炭表面，不仅有利于增强漆酶对环境pH和温度的适应性，也促使BPA能够有效地吸附在活性炭颗粒表面并加速漆酶与底物分子之间的电子转移，从而显著地提高了漆酶对填料床柱中BPA的去除效率及其循环再生能力。此外，将漆酶固定在表面改性的无机多孔载体上，也能够强化漆酶对水体中BPA的去除和转化作用。如图5所示，采用吸附法将变色栓菌（Trametes versicolor）漆酶固定在改性的脱铝Y型沸石中，不仅提高了漆酶的固定化产率和效能，也增强了漆酶对BPA的去除效率（86.7%），反应体系中BPA的转化中间产物主要包括对苯二酚和4-异丙基苯酚［57］。

图5 漆酶在改性沸石上的固定化率及其对BPA的降解机理［57］

3.4 高分子材料固定漆酶的操作工艺及其在BPA转化中的应用

天然源的高分子聚合物如壳聚糖和海藻酸钠水凝胶可提供生物相容性环境，将生物分子固定在所需的聚合物网络中［69，75］。因此，这些无毒无害的天然聚合物能够作为漆酶的固定化载体，提高漆酶的稳定性、催化效能和循环利用率［75］。例如，与游离态漆酶相比，将漆酶固定在明胶、琼脂和聚丙烯酰胺基水凝胶中，可以明显增强漆酶的催化活性、热稳定性和动力学特性。此外，水凝胶载体也具有良好的截留效果和吸附性能［76］。Skoronski等［77］研究表明，将来源于黑曲霉（Aspergillussp.）的漆酶固定在壳聚糖中可以显著地增强漆酶对酚类污染物的去除效率。Lassouane等［14］采用戊二醛交联法，将绒毛栓菌（Trametes pubescens）粗漆酶包埋在海藻酸钙小球中，有效地提高了漆酶的固定化产率；该固定化漆酶在2 h内对水溶液中BPA的降解效率高达99%以上（反应条件为87.6 μmol/L BPA、1.5 U/mL漆酶、pH 5.0和30℃），且循环使用10次后其对BPA的去除率仍保持在70%以上。另有报道［78］将Cu2+和Mn2+螯合在负载壳聚糖的Fe3O4颗粒表面，制备带正电荷的磁性高分子微球；然后，通过使带负电荷的漆酶结合在带正电荷的磁性Fe3O4微球上，该固定化漆酶的活性可达100%。图6展示了将天然高分子材料制备的固定化漆酶填充在流化床反应器中对废水中BPA的去除工艺［40］，该处理技术有望大规模的用于连续高效降解废水中BPA。

图6 天然高分子聚合物小球填充的流化床反应器示意图［40］

3.5 酶膜反应器连续高效去除废水中BPA的工艺流程

与吸附、高级氧化、电化学降解和生物转化等方法相比，酶膜反应器对环境中EDCs的去除效率更高，且该技术具有生态友好、易操作和可大规模应用等特点［79-80］。因此，将漆酶固载在酶膜反应器中，用于高效、安全的降解废水中BPA已经受到研究者的广泛关注。已有资料显示，漆酶在膜反应器中的固定可以显著地改善酶的负载率和催化活性，但是也会造成酶的通透性损失，且无法避免酶在生物利用过程中的浸出［81］。近年来，研究者利用漆酶溶液的反渗透原理合成的双面生物催化膜，能够有效改善酶膜反应器的性能缺陷，实现BPA的高效生物转化［82］。该技术的原理是利用压力诱导的对流传质增强漆酶对BPA的利用率，同时去除堆积在膜上的BPA转化产物。此外，Nguyen等［83］也开发出一种新型酶膜反应器，用于连续高效消除废水中BPA。该技术采用超滤膜防止漆酶流失，其在连续催化反应体系中对BPA的去除率为80%，而添加天然介质丁香醛可使BPA的去除率高达95%以上。另有报道［41］采用共价结合法，将来源于血红密孔菌（Pycnoporus sanguineus）和变色栓菌（Trametes versicolor）的漆酶固定在多通道陶瓷膜表面；结果发现，该酶膜反应器在24 h内能够完全去除水体中的BPA。图7展示了利用漆酶膜反应器去除废水中BPA的工艺流程和作用机理，该反应体系中BPA的主要酶促产物包括BPA氧化降解产物和聚合产物［79］。这些结果表明，优化漆酶的固定化方法不仅能够提高漆酶的稳定性、催化效率和循环再利用能力，也有望将其大规模应用于废水中BPA的去除。尽管如此，研究者仍需明确漆酶介导BPA转化中间产物的生态毒性。

图7 酶膜反应器去除废水中BPA的作用机理［79］

4 漆酶催化反应中BPA转化中间产物的生态毒性评估

漆酶来源、反应条件和介质种类等因素可以显著地影响酶促反应中BPA转化产物的产量和种类，其中BPA的某些转化中间体产物如4-异丙基苯酚、羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、对羟基苯甲酮、对苯二酚和2-苯基丙烯等的生态毒性要高于母体化合物［84-85］。此外，有些BPA芳香环中间体产物的形成、积累及其协同作用，甚至能够诱发生物体的急性中毒。因此，明确漆酶催化氧化反应中BPA及其相关中间体产物的生态毒性具有重要意义。例如，de Freitas等［36］调查指出，与未添加漆酶处理组相比，经过糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）漆酶催化处理的BPA反应液对费氏弧菌（Vibrio fischeri）的急性毒性由85%降低至5%以下；而采用肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius）漆酶处理的BPA溶液对该菌株的急性毒性仍然高达85%左右，表明反应中至少产生了一种与BPA毒性相当的中间产物。另有研究者［14］将来源于绒毛栓菌（Trametes pubescens）的粗漆酶固定在海藻酸钙微球中，结果发现该固定化漆酶催化氧化后的BPA中间产物对萝卜种子（Raphanus sativus）没有产生毒害作用。由此可见，漆酶催化BPA的氧化降解产物可能仍保留较高的生态毒性风险。尽管如此，研究者［46-47］指出利用漆酶催化氧化的另一特性，即通过自由基介导的C-C和C-O-C共价耦合途径形成BPA聚合产物可有效规避其生物毒性，且这些聚合沉淀物能够通过简单的离心或过滤加以去除。因此，优选漆酶的固定化方法和工艺处理条件，防控大规模酶促反应过程中产生二次污染问题是实现BPA废水绿色、安全排放的重要前提保障。

5 总结与展望

真菌漆酶修复BPA污染的废水具有反应条件温和、降解效率高、操作可控和无毒无害等优点，已经成为一种理想型的废水生物处理技术。然而，真菌漆酶的生物合成和纯化费用昂贵，难以满足其在废水处理中的大规模应用。因此，如何获得低成本漆酶已经成为研究者亟待突破的瓶颈。目前，DNA和蛋白质重组技术有望批量生产漆酶，以实现其在环境修复中的广泛应用。另一方面，pH、温度、金属离子和有机质等环境因素均可影响漆酶在废水中的催化活性和稳定性，如何精心设计耐抑制性的漆酶催化反应体系至关重要，这将显著地提高漆酶对废水中BPA的处理效率。

目前，固定化技术的快速发展为利用漆酶连续高效处理BPA污染的废水提供了可行性。漆酶的固定化可以增强酶的催化活性，提高酶的热稳定性和存储周期，并有利于酶的循环再利用。近年来，利用纳米材料、磁性颗粒、多孔材料和高分子聚合物等作为漆酶固定化载体的研究已经备受学者关注。该类固定化载体不仅具有独特的理化性质和结构属性，同时也拥有生物酶的催化功能。然而，研究者仍需从以下两个方面进行深入探讨，进而开发出新型高效固定化漆酶，应用于大规模处理BPA污染废水。（1）在分子水平上表征漆酶与BPA的作用关系，明确环境因子、抑制剂和共污染等外部条件对漆酶催化BPA的影响；（2）固定化载体与漆酶催化位点的链接，确保酶修饰不会对漆酶的催化活性和稳定性造成影响。