酱菜发酵中微生物的研究

高吉祥，燕平梅

(太原师范学院 生物系，山西 晋中 030600)

1 酱菜的起源

酱菜是一种经盐腌、微生物发酵和酱渍而成的蔬菜加工品。酱菜加工在中国有悠久历史。中国人民利用食盐和天然微生物加工蔬菜的历史至少已有两千多年,最早发现的记载是在先秦时期典籍中。在《周礼·天宫》中记有:“大羹不致五味，铡羹加盐菜”[1]。(汉)许慎在《说文》中有:“菹菜者，酸菜也”。《说文》里所说的菹菜就是一种利用乳酸菌发酵制成的酸菜。

在北魏时期书籍中也有明确的记载，北魏杰出的农学家在其著作《齐民要术》中记录了数十种的“菹”，这是我国在制作酱菜的工艺历史中非常重要的历史资料。

除了书本中的记载外，在1971出土了目前储藏时间最长的酱菜——豆豉姜，这是中国目前发现的最早的酱菜实物。

我国制作酱菜的水平在明朝、清朝时期达到了顶峰，不仅酱菜的品种非常丰富，其品质在今天也是极其优异。这是勤劳聪明的中国人民对人类饮食文明的伟大贡献。

酱菜的种类有很多，口感味道迥异，按照地域大致可以划分为南、北两大类。

酱菜在我国历史悠久，且受众极为广泛，在中国从南到北都可以找到酱菜的踪影，不同地方的酱菜因为材料、腌制方法的不同产生出了众多的酱菜种类。众多种类的酱菜可以根据口味分为南、北两种。北方酱菜主要有北京的“六必居”、“天源”以及河北保定的“老槐茂”、“大慈阁”。南方酱菜则是江苏省扬州地区的扬州酱菜，其中又以“三和”和“四美”最为著名。从口味上来讲，北方的北味酱菜整体偏咸，而南方的南味酱菜则更符合南方人的口味整体偏甜。

本小节将会分别介绍北方、南方各自的代表六必居酱菜和扬州酱菜。

1.1 北方和南方的酱菜代表

1.1.1 六必居酱菜

作为北味酱菜的代表——六必居，其名号之响、历史之久，在北方酱菜中是较拔尖的。六必居酱园的历史相传开始于明朝，传承至今已有将近490年的历史[2]，由山西临汾的三兄弟联合创办。经过近5个世纪传承的六必居的酱菜已经是我国最有名的酱菜之一，因此也成功地入选我国非物质文化遗产目录。

“六必居”的名称来自于其对酱菜制作工艺的严格要求：即“酱菜的原料必须齐全，必须按照自己的配方如实投料，用来制作酱菜的曲料必须是洁净的，盛放成品的器皿必须是优质的，制作的工艺必须到位，制作用的必须是上好的泉水”[3]。六必居对酱菜制作执着的“六必”的要求是对品牌的保证、对顾客的负责，也代表着几千年来中国劳动人民的智慧结晶沉淀的对酿造水平最高标准的要求。

六必居的酱菜曾经作为皇家食品，可见受人们喜爱之深。其酱菜具有鲜亮的色泽、清香脆嫩的口感、浓郁的酱味，吃起来咸甜适中，咸中带甜。

六必居能够作为中华老字号经久不衰，与其严谨的制作工艺的有密不可分的关系。

为了确保所卖酱菜的高质量，六必居在原料的选择、酱的制作以及其他的步骤上都有极其严格的标准。

此外，还会根据季节以及酱菜品种的不同来采用不同的制作工艺，从而使每个品种都有其独一无二的风味，比如仅仅酱菜咸胚的腌制就有干腌、曝腌、卤腌等一系列方法。

1.1.2 扬州酱菜

江苏省扬州地区的扬州酱菜是南味酱菜的代表，在扬州光是制作酱菜的酱坊就有100多家。在众多的酱坊中又数“三和”、“四美”最为有名。“四美”酱菜的名称出自唐朝著名诗人王勃的《滕王阁序》中“四美具，二难并”的典故，表达其酱菜脆嫩鲜甜之意。而“三和”酱菜的名字则为色香味皆佳之意，乃酱坊的主人自己所取[4]。

扬州酱菜历史十分悠久，在汉朝开始出现，在隋唐时期得到了很大的发展，在明清二朝发展到顶点，甚至在清朝成为了皇家御膳的常客。扬州酱菜不仅有非常悠久的历史，而且在历史上也曾获得很多的大奖：1903年，获得西湖博览会金质奖；1911年，获得国际博览会奖章；1931年，获得北平全国铁路沿线物品展览会一等奖；1979年，被评为江苏省优质产品。

扬州酱菜有着非常鲜明的特点，不仅有着浓郁的酱香，脆嫩鲜甜、咸甜适中的口感而且其色泽明亮，块型美观，是酱菜中不可多得的精品。扬州的“三和”、“四美”酱菜历史悠久，工艺独特，食用后口中鲜味缠绕，深受广大群众的喜爱，甚至远销海外。

1.2 酱菜的制作原理及其制作步骤

1.2.1 原理

蔬菜是我们每天餐桌上的主角之一，但由于其不宜长时间存放且十分容易腐坏，所以蔬菜有着非常明显的季节和地域的局限性。在古代，想要在冬天吃到蔬菜尤为困难，而酱菜的出现，使其成为可能。

酱菜的主角就是新鲜蔬菜，食盐、酱等调味品也是酱菜制作过程中不可或缺的材料，把新鲜蔬菜使用盐腌制，一定浓度的食盐可以减少有害菌的生存，然后沥干菜中多余的水分，再根据个人喜好或者需求加入各种不同的酱油以及香辛料、糖等调味品进行制作，使酱油中的营养成分可以进入菜中，使酱菜成品营养、健康、美味，又易于存放[5]。

酱菜的制作中包含了一系列菌群的活动。在乳酸菌，酵母菌和醋酸菌的共同作用下，新鲜蔬菜最后就会变成拥有特别风味和口感的酱菜。

1.2.2 酱菜的制作步骤

酱菜的制作步骤见图1。

图1 酱菜的制作步骤Fig.1 The production process diagram of pickles

原料选择：选择新鲜良好的蔬菜，丢弃发霉、腐烂等不好的。

处理：对蔬菜进行初步的处理，把附着于蔬菜表面的灰尘、泥土或者其他杂质清洗干净，必要时做杀菌处理。

盐腌：把洗干净沥干的蔬菜与食盐按照一定的比例进行腌制。需要定时对蔬菜进行翻搅，使蔬菜腌制均匀。

切制改形：按照需求将蔬菜进行均匀切制，一般选择切块处理。

脱盐、脱水：对腌制过的蔬菜进行降低其含盐量的操作，可加入清水，刚没过蔬菜即可，并进行按时更换。将脱盐后的蔬菜通过晾晒等方式降低其所含水分，然后备用。

酱制：将事先调制好的香辛料和调味品加入蔬菜中，可根据消费者需求制作不同口味[6]。然后加入酱进行腌制，需要定时翻搅，使酱汁尽可能均匀地渗入蔬菜细胞内，通过各种微生物的相互作用，使得酱菜别具风味。

2 酱菜制作中主要的微生物

酱菜的制作过程中会有多种微生物参与，从本质上来说，酱菜制作就是微生物在分解、发酵蔬菜的过程[7]。

2.1 酱菜制作中主要的微生物

酱菜的制作过程就是蔬菜被分解、发酵的过程。在此过程中，微生物的发酵可以分为两种：一种是有益菌的发酵作用，主要有乳酸发酵、酒精发酵、醋酸发酵，微生物主要有乳酸菌、酵母菌、醋酸菌；另一种发酵是有害菌发酵，主要有丁酸发酵、腐败细菌的腐败作用、有害酵母发酵、霉菌的作用，微生物主要有产膜酵母、大肠杆菌、霉菌、枯草芽孢杆菌、荚膜杆菌、荚膜粘化菌、腐臭杆菌等。

2.2 酱菜制作中各种微生物的发酵过程

酱菜的发酵过程可以大致分为三个阶段：第一阶段为乳酸菌发酵阶段，第二阶段为酵母菌发酵阶段，第三阶段为醋酸菌发酵阶段。其中，第一发酵阶段——乳酸菌发酵，是酱菜制作中最重要的发酵过程。乳酸菌的发酵又可以分为三个阶段：微酸阶段、酸化成熟阶段和过酸阶段。

除了有益菌的发酵之外，通常还不可避免会有杂菌的发酵。

2.2.1 乳酸发酵2.2.1.1 微酸阶段

刚开始表面附生的乳酸菌和腐败菌共同生长→(嫌气条件)乳酸菌占优势→(微酸)抑制杂菌生长。此时起主要作用的微生物是乳酸菌，而肠膜明串珠菌是这一时间段增长最快的微生物。

2.2.1.2 酸化成熟阶段

乳酸浓度越来越高，达到酸化成熟阶段。微生物的特点：杂菌(腐败菌)受到抑制。乳酸菌的主要类群：肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、短乳杆菌和发酵乳杆菌[8]。

2.2.1.3 过酸阶段

此时酱菜发酵液中乳酸浓度过高，乳酸菌的一系列活动、繁殖受到抑制，其他微生物活动几乎停止[9]，蔬菜得以保存。pH值作为酱菜发酵中的一个重要指标，它的变化可以反映发酵的程度。当pH值范围在3.18～3.16之间时,产品的色、香、味俱佳,为产品形成期，此时乳酸含量为1%左右(如果酱菜的密封不严，那么白地霉菌和野生的酵母菌就会利用乳酸大量繁殖，造成酱菜的腐败)。

2.2.2 酵母发酵

随着发酵的不断进行，酱菜中可发酵糖分会不断被乳酸菌所消耗。因此，酱菜在经过充分的发酵以后，可发酵糖含量一般很低。尽管只有很少一部分的可发酵糖，也可能会被杂菌所利用，从而致使酱菜加快腐败变质，对后期贮藏不利。然而此时因为之前的乳酸发酵产生的乳酸导致发酵液中的pH变得很低，从而会致使乳酸菌难以继续发酵糖，但是酵母菌却可以在此时继续发酵，将剩余的糖分分解为乙醇和CO2，其具体过程为：

C6H12O6→2CH3CH2OH+2CO2↑。

(1)

酵母菌不仅解决了乳酸菌难以完全利用糖分的问题，而且所产生的酒精在酱菜的风味贮藏方面起着有益作用。

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2.2.3 醋酸发酵

在酱菜发酵的过程中，会有少量的醋酸菌存在。醋酸菌可以将酒精转化成醋酸，其具体过程为：

C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O。

(2)

进而还可以转化成具有特殊香味的乙酸乙酯。

2.2.4 杂菌发酵

酱菜在腌制过程中通常会不可避免地混入杂菌，所以在酱菜制作过程中往往也会有杂菌的发酵。

大肠杆菌是发酵初期的有害菌，会让酱菜发酵液腐败以及产生有害物质亚硝酸。丁酸菌等一系列腐败菌的繁殖则会产生具有强烈臭味的丁酸。而一些腐败性细菌则会消耗酱菜中的营养物质,使产品变质、产生恶臭味,同时产生一些如亚硝胺等的有害物质[10]。

产膜酵母的大量繁殖会使酱菜表面呈现一层白灰色的膜，而且在有氧的条件下可以消耗有机酸，导致发酵液的pH值增大，失去了对杂菌的抑制效果。白地霉等霉菌在有氧的环境中会令发酵液pH升高，导致其他杂菌繁殖。

2.3 酱菜制作中各种微生物的发酵作用

2.3.1 乳酸菌对酱菜发酵的作用

乳酸菌的发酵是整个酱菜制作中最重要的微生物发酵过程，对酱菜的风味、口感形成都有重要的影响。

乳酸菌乳酸发酵可以将碳水化合物变成有机酸——乳酸[11]。乳酸不仅会让酱菜产生一种独特的酸爽口感，而且高浓度的乳酸会降低酱菜发酵液的pH值，对抑制杂菌有着非常不错的效果。

因为体内缺少蛋白酶缘故，所以乳酸菌的发酵过程只会利用酱菜发酵液中的碳水化合物和氨基酸等可溶物，而不会对蔬菜的植物细胞中的原生质进行消耗，所以会让酱菜组织有较脆的口感和独特风味。

2.3.2 酵母菌对酱菜发酵的作用

因为乳酸菌在酱菜的制作中起到了最重要的作用，因而人们对乳酸菌进行了较为全面的研究。相比之下，对酵母菌的研究很少，而对其在酱菜制作中所发挥作用的研究资料更少。但是酵母菌对于酱菜的口感、风味和储存都起到非常重要的作用。

醇香作为酱菜香味的主要来源之一，非常重要。因而酱菜的制作中往往要添加一定量的白酒，在给酱菜增加醇香的同时又能起到抑制杂菌繁殖、防止“生花”的双重作用。而酵母菌的发酵作用，既能生成酒精，还能与有机酸相互反应从而生成一些具有特殊香气的酯类芳香成分。

与此同时，酱菜发酵液中碳水化合物会随着时间的推移而被微生物一直利用，到最后其碳水化合物的含量往往非常低。但是也会被其他杂菌利用加快腐败变质，对后期的储存造成影响。然而此时酱菜发酵液中的低pH会导致乳酸菌无法利用继续发酵，而酵母菌对碳水化合物的利用效率非常高，而这一点对酱菜发酵后的贮藏非常有益。

2.3.3 醋酸菌对酱菜发酵的作用

在酱菜发酵制作中，通常会有一些醋酸菌存在，虽然其数量不多，但会在有氧的环境下，把乙醇转化成乙酸，进而还可以转化成乙酸乙酯，通常少量的醋酸菌会对酱菜的制作有益，但是大量的醋酸菌会造成酱菜制作的失败。

2.3.4 霉菌对酱菜发酵的作用

霉菌，尤其是具有果胶水解能力的霉菌会软化蔬菜组织，导致酱菜发酵液严重腐败。但通常在缺氧条件下却难以生长，此外，高渗透压的食盐溶液会让霉菌更加难以生长。当霉菌在蔬菜表面和菜卤中生长时，会造成酱菜发酵液pH降低，腐败，并产生有害物质[12]。

2.4 酱菜制作中香味的形成

2.4.1 蛋白质分解

在酱菜的腌制过程中以及最后的成熟期中，酱菜中所含的蛋白质会在酱菜原料自身所含蛋白水解酶和外来微生物的共同作用下被逐渐分解为各种氨基酸分子，这是酱菜产生各种特殊香味的主要原因之一[13]。

2.4.2 鲜味的形成

谷氨酸与食盐作用生成的谷氨酸钠是酱菜鲜味的主要来源。此外，乳酸菌产生的乳酸也是酱菜鲜味形成的重要原因。

2.4.3 香气的形成

酱菜的香气是多种原因综合作用的结果，也是一个复杂而缓慢的生化过程。氨基丙酸本身具有一定的香气；酵母菌发酵产生的微量乙醇也有一定的香味；乙醇与氨基酸和醋酸菌产生的乙酸作用所生成的酯类物质则拥有更浓的香气。

另外，氨基酸与戊糖或甲基戊糖的还原产物相作用，也可生成十分浓郁的芳香酯类[14]。酸乳酸和醋酸都可与乙醇化合而生成具有特殊香气的酯类物质。酱菜腌制过程中加入各种香料如花椒、胡椒等也会增加酱菜的香气。

2.5 微生物的研究方法

2.5.1 传统的培养方法

传统的培养方式是通过对各种菌群生存条件制作相应的培养基，使其生长繁殖。通过菌群各方面特征从而对酱菜制作中的多种菌群进行鉴定。该方法操作简便且耗时短，目前依然使用，尤其是在实验室很常用。该法操作过程中需要保证严格的无菌环境，但在实际操作中很难做到绝对的无菌，因此，其结果难免有偏差；而且对于菌群的生长所需环境条件也很难完整还原，所以在研究酱菜中微生物时具有一定的局限性[15]。

2.5.2 变性温度梯度凝胶电泳技术(DGGE/TGGE)

DGGE是以聚丙烯酰胺等物质作为介质，用于对DNA分子的分离、检测。该方法比较灵敏，理论上可检测出不同的DNA序列中一个碱基的区别；效率较高，可同时分离多个DNA分子片段；速度快，可用于监测酱菜发酵不同时期活跃的菌群[16]。这种方法已经用于酱菜制作中的菌群研究且逐渐用于其他领域。但是，这种技术不能用于较大片段的研究(适用>500 bp)；难以反映在酱菜中弱势种群的状态[17]。

2.5.3 高通量测序(high-throughput sequencing)

高通量测序技术是近年来兴起的一种技术，每次可对多条序列进行分析。在很多领域相继投入使用，其中包括酱菜发酵中微生物的研究。这种技术的使用大大确保了研究结果的准确性，对于酱菜中弱势菌群的分析依然全面准确，基本不受影响。然而该种技术对数据的处理需要用到多种专业的软件，往往需要专业的人员操作才能得出最终结果，且对经济方面有一定的要求，因此难以普及[18]。

2.5.4 荧光定量PCR

荧光定量PCR是通过在PCR扩增时加入一个荧光标记的特异性探针，达到对反应定时定量的监测。可用于在酱菜制作中不同时期不同菌群的监测。该种方法有对反应的准确监测；速度快；效率高；且通过双重控制，可增加对靶序列的识别特异性。但是该方法过程中使用的部分试剂会对人体有一定的伤害；而且其结果受多方面原因影响，导致和真实结果之间存在差异[19]。

2.5.5 限制性片段长度多态性技术(RFLP)

RFLP是利用限制性内切酶可以特异地识别、切割DNA片段的原理，设计一段具有多态性的限制性内切酶的DNA序列，通过限制性内切酶对扩增产物作用后的片段进行分析，得出结果。该方法适用于对菌群的分析。该种技术的结果具有很高的准确性和该过程可重复性。然而设计一段合适的引物极具挑战；该方法对于DNA的纯度具有较高的需求[20]。

3 提高酱菜制作的成功率

酱菜制作的核心过程就是各种微生物发酵的过程，需要各种微生物的参与，其酱菜的质量自然与这些微生物密切相关。那么就可以通过人为地控制微生物来提高酱菜制作的成功率，例如：增加对酱菜有益菌群的积极影响，控制杂菌的带入和生存环境。

3.1 保证有益菌的发酵

在酱菜的制作工艺中最重要的是乳酸菌。不同种的菌群对生存繁殖的环境要求不尽相同，在酱菜的制作工艺中活跃的时间也不同。为了保证有益菌的发酵，可以在无菌的条件下人工引入所需要的纯净优质的菌种，从而尽可能地减少杂菌的污染。并且，根据不同微生物起作用的时间来调整酱菜制作的条件，从而提高有益菌对酱菜的积极影响。

3.2 避免杂菌的污染

在古代，科学技术不先进，制作酱菜所必需的微生物，如乳酸菌、酵母菌等都是来自自然界的天然菌，而自然界的微生物往往不纯，在引入有益菌的同时，可能混有其他的杂菌。酱菜制作的环境也难以保证无菌环境，也会导致杂菌的污染，而这些不需要的杂菌会影响酱菜的品质。在现代技术的加持下，可以在酱菜制作中采用巴氏消毒法或超高温瞬间灭活把新鲜蔬菜所携带的微生物杀死，然后引入纯种有益菌，避免杂菌污染。

3.3 抑制杂菌的发酵

3.3.1 食盐

高浓度的盐水可以起到一定程度的抑制杂菌的效果。研究发现1%的盐水产生的渗透压高于部分菌体细胞内部，最后菌体可因过分失水而死亡。而酱菜制作中起主要作用的乳酸菌属于耐盐菌，故而适量的食盐可以抑制杂菌而不影响酱菜的正常发酵。

3.3.2 温度

不同的微生物有不同的最适繁殖温度，适当控制酱菜制作中的温度可以达到抑制杂菌的效果。

3.3.3 pH

不同的菌群都有自己适合生存的最佳酸度范围，过分酸、碱均可影响其生长繁殖甚至使微生物死亡。而酱菜发酵过程中的乳酸菌、醋酸菌都可以产酸，使得酱菜酸度增加，从而可以抑制部分不耐酸有害菌的生长。

4 总结

酱菜作为一种具有悠久历史的蔬菜腌制食品，是中国人生活中常见的食物之一。酱菜是新鲜蔬菜的一种保存方式，通过食盐、酱等的腌制，在多种微生物的影响下形成的一种美味小菜。

因此在酱菜的制作过程中，对各种微生物的作用变化有一个清晰的认识就变得非常有必要，这样才能在制作和食用酱菜的过程中更加安全合理。

酱菜的制作工艺中微生物的存在及其意义非常重要。本文对酱菜的制作工艺中起作用的微生物及其菌群对酱菜的影响进行了研究，阐述了酱菜制作中各种微生物发酵的顺序、方式以及对酱菜成品产生的影响。酱菜作为一种非常普遍、非常受欢迎的传统食品，对人们的饮食方式和习惯产生更加广泛、深远的影响。因此对酱菜制作的研究，提高酱菜的质量有着非常重要的意义，进一步的研究应该加深不同微生物之间相互作用对酱菜风味的影响，为新型风味酱菜的制作提供研究资源。