间充质干细胞来源的脱细胞基质及其研究进展

冯煜婷，姜治伟，杨国利，谢志坚

组织工程学研究的兴起解决了以往器官和组织移植的来源问题，二十余年的发展使其在种子细胞、生物材料、细胞与生物材料的整合以及植入物与体内微环境的整合等方面得到不断革新。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)应用于再生医学已有超过500次临床试验，共涉及2 000例以上患者[1]，包括骨和软骨、神经系统、心血管系统等不同疾病模型。

然而MSC在实际临床应用时还存在很多问题，首先是数量问题，MSC需经过体外培养才能达到足够治疗的细胞数量；另外，给药的时间、剂量和方式仍没有统一的认识，尤其是给药方式。系统给药会导致细胞在非靶器官聚集，甚至可能引起栓塞、材料吸收等情况，局部给药则有出血和组织损伤的风险。对于这些给药参数较难找到最适搭配，因此有人提出并开始实践使用MSC的分泌产物或分泌因子来代替直接应用细胞，即无细胞疗法[2]。近年来，MSC来源的脱细胞基质(mesenchymal stem cell derived extracellular matrix, MSC-ECM)作为一种新型的生物材料，因其供源丰富、免疫原性低等优势逐渐被重视。

1 MSC-ECM的主要成分与制备

MSC的分泌产物又称MSC-分泌蛋白质组，包括细胞外基质和细胞粘附蛋白、酶、酶抑制/促进剂、生长因子和生长因子结合蛋白、细胞因子、趋化因子以及一些基因产物如micro RNA，其中ECM蛋白占的最多[3]。对于MSC分泌蛋白质组的成分目前还在研究中，ECM主要成分包括胶原、蛋白聚糖、糖蛋白及其他非胶原糖蛋白[4]，围绕在细胞周围，为细胞的增殖和生长提供相应的环境[5]。近年来，有一些团队开始尝试脱细胞的方法来制取MSC-ECM，并通过再细胞化进行体内体外实验研究。

脱细胞的概念来源于器官和组织移植的研究[6]，是指除去细胞成分以减少免疫反应的过程，最终获得三维的有天然成分和组织结构的生物支架。脱细胞后，将需要的细胞重新接入，创造可植入体内的功能性移植物，称为再细胞化。

利用体外培养的MSC制备ECM需要三个步骤[7]。

① 培养产生ECM。标准培养基体外培养MSC，同时补充维生素C(Vitamin C，Vc)来增加胶原及其他ECM成分的合成[8-9]，一些惰性分散的大分子物质[10]如硫酸葡聚糖70和400、卡拉胶[11]等也可加快ECM的产生。另外，在标准的细胞培养表面预铺如聚二甲硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)[12]来固定细胞，可促进细胞生长和粘附，防止ECM部分脱离。

② 脱细胞。与整块组织和器官脱细胞相比，细胞来源的ECM获取时间更短、更温和，不同脱细胞方法的效果略有不同[13-14]。最常用的试剂是氨水和Triton X-100，两者能够溶解细胞膜而不破坏单分子层[15]。为了除去ECM中的细胞质成分，还需要用到核酸酶(DNA酶和RNA酶)。也有研究表明使用不同的洗涤剂[12]，如脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)，或快速反复冻融[16-17]，可以有效脱去ECM中的细胞。

③ 鉴定。采用蛋白质组学[3,18]进行蛋白定性和定量检测，PicoGreen DNA定量分析检测遗留的DNA含量[17]。其他如扫描电镜[19]、原子力显微镜[20]、免疫荧光染色[18]、免疫组织化学染色[21]等，用于观察MSC-ECM的主要成分及表征。

2 MSC-ECM的应用

MSC-ECM的作用主要集中在三个方面[22]：作为细胞培养的基质；保护细胞不受外在培养因素的影响；作为可溶因子的载体或储存器。MSC-ECM能够促进在其上面培养的细胞的增殖、生长以及定向分化[23]。

2.1 MSC-ECM促进骨形成

MSC-ECM常与人工支架材料结合应用，如可与胶原/羟磷灰石复合体组装模仿“骨髓龛”[24]，结果显示再细胞化MSCs的增殖速率和成骨分化潜能显著提高。为了最大程度上减小免疫原性，有学者选择利用化学试剂去除原有的支架材料，仅剩下3D结构的ECM，体内实验证明了其免疫原性降低[25]。还有研究制备了不需要支架材料且完整保留ECM结构和相关生长因子的成骨诱导MSC-ECM片层，并发现该片层中富含骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)与转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等促进骨缺损修复的细胞因子[26]。

MSC-ECM上培养的MSCs即使培养基中没有成骨诱导的成分，依然可以向成骨分化，在大鼠皮下植入ECM和细胞的水凝胶，也发现骨形成、血管密度和细胞活性都有所增加[27]。甚至对于衰老的MSCs，在年轻MSC-ECM上培养也可以恢复其增殖和成骨活力[28]。另外，若在培养基中加入成骨诱导成分，获得的MSC-ECM能够促进再细胞化细胞的成骨分化和生物矿化[29-30]。

2.2 MSC-ECM促进软骨形成

软骨细胞在体外标准培养基中培养时易去分化[31]，而MSC-ECM能够显著促进软骨细胞的增殖速率并且维持软骨细胞特性[32]，制备软骨细胞/ECM复合体，体内外实验均证明其促进软骨形成的作用。研究表明，成纤维细胞来源的ECM会减少脂肪干细胞的增殖，但是可通过Notch1和β-catenin信号通路促进其成软骨分化并防止细胞衰老[33]。

然而与软骨细胞来源的ECM相比，MSC-ECM的维持软骨细胞形态和促进软骨形成能力相对较弱[34]。研究表明，即使培养基中没有成软骨诱导的相关因子存在，软骨细胞来源的ECM仍然可以促进MSC的成软骨分化[35]，且可能是通过调控微环境中的BMP-2实现[36]。

2.3 三维培养与混合培养

MSC-ECM的组成由于对培养环境较为敏感而易被调控[37]，如转染Notch1后有11种ECM蛋白会发生变化[15]，因此在培养产生ECM的步骤中添加特定成分或改变培养条件，可以得到预想的结果。通常获得MSC-ECM的是单层结构，对于临床应用来说厚度明显不足，Lee等[38]采用纤连蛋白和明胶作为ECM内核，一层层裹上人皮肤成纤维细胞后，用热膨胀水凝胶构建三维结构，然后改变温度使之分离，获得单纯的三维细胞膜片，厚度可达78.8 μm。MSC通过三维培养，ECM蛋白(主要是Ⅰ型胶原、纤连蛋白和层粘连蛋白)增多[39]。将ECM与3D打印支架结合，再细胞化后发现成骨相关基因runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨钙蛋白、骨桥蛋白是空白组的3～4倍[40]。

研究表明，多层细胞膜片结构相比单层的细胞膜片在应用治疗时表现出更为强大的组织再生功能和更好的疗效[41]。多种类型细胞混合培养是为了模拟组织内复杂的细胞成分以及其分泌的ECM蛋白种类。脱细胞获得ECM后，成骨细胞与软骨细胞共培养获得的ECM相比单纯成骨细胞ECM，拥有更强的促进成骨分化能力[35]。

3 不同组织来源的MSC-ECM

间充质干细胞可以从多种不同组织中提取：骨髓、脂肪、真皮组织、牙体组织、外周血、滑膜组织、胚胎组织、羊水、胎盘、脐带血等。其中脂肪组织中含量最高[42]，是骨髓的500倍[43]，且提取方法简便，因此被认为是比较理想的MSC来源。不同组织来源的MSC产生的ECM和基质金属蛋白酶的浓度和组成有所不同[44]，其再细胞化细胞的成骨、成软骨分化能力也不同。

Choi等[45]的研究发现前成骨细胞和成纤维细胞脱细胞后获得的ECM表面纤维的形态和大小不同，再细胞化MSC后，前成骨细胞ECM上MSC成骨分化更多，后者成软骨分化多。有趣的是，羊水和骨髓来源的MSC-ECM在成骨诱导液中培养后脱细胞，发现细胞在空的培养皿和ECM上的增殖、生长无差异，但是钙含量在骨髓来源的MSC-ECM中最高[17]。

MSC可分化为成骨细胞、成软骨细胞、成纤维细胞、成肌细胞和脂肪细胞[46]，除脂肪细胞外，都有制成细胞膜片后经过脱细胞处理获得ECM的报道，用于研究不同组织缺损修复。

4 MSC-ECM在口腔领域的应用前景

MSC-ECM虽然目前仍处于基础研究阶段，其在口腔临床却有着广阔的应用前景，尤其是口腔种植和牙周领域。Takewaki等[47]制备了MSC/ECM复合体，体内实验验证了其促进牙周组织再生的能力。Lee等[48]用癌化的人牙周膜细胞和成牙骨质细胞，加上用于增加血供的人脐静脉内皮细胞，与Malassez上皮剩余细胞促进牙周组织再生，四种细胞形成单层或多层的膜片裹在种植体表面，结果显示可以恢复牙周膜的部分形态和功能。ECM无细胞成分，免疫原性显著小于常规种植体表面的细胞膜片，且储存简便，伦理限制也相对较小。若能够解决粘附、固定问题，改进表面成骨组分，可逐步投入商业化生产。另外，引导组织再生所使用的生物膜也可考虑应用MSC-ECM。

当然，MSC-ECM还需要更多基础研究支持，ECM的有效成分及机制仍需明确，残留脱细胞试剂问题、应用于临床消毒灭菌方式的选择、减少ECM的异质性、MSC的培养条件优化、可注射的MSC-ECM水凝胶等都是未来的研究方向。

5 结 论

MSC-ECM因其独特的生物机械和化学特性，能够为体外细胞的粘附、增殖和分化提供一个适宜的微环境，成为细胞培养的平台，也可以作为组织工程产品的起始材料，符合质优、安全和高效的治疗原则。目前对于MSC-ECM的研究涉及不同领域不同方向，主要集中在促进定向分化和性能改良上，未来有望成为组织工程学最常用的重要材料之一。