再生性牙髓治疗的临床和组织学结果的描述性系统评价

陈 霞，汪成林，叶 玲

再生性牙髓治疗(regenerative endodontic procedures，REPs)属于组织工程范畴，被定义为以生物为基础的治疗方法，旨在修复或替换受损组织，包括牙本质和牙根结构以及牙髓-牙本质复合体的细胞[1]。它是由Ostby[2]于1961年首次使用，由Iwaya等[3]修订，并由Murray等[1]正式命名。从报道的病例看，牙髓坏死或伴有根尖周炎的年轻恒牙经REPs后，临床结果往往较好，只有少数病例失败[4-5]。为规范治疗效果评价，美国牙髓病学协会(American Association of Endodontists，AAE)针对REPs先后提出4个版本的临床指南，目前已更新到2018年4月的版本，其中将治疗效果评价分成三级：初级目标为临床症状消失及骨修复；二级目标为根管壁厚度增加和/或牙根长度增加；三级目标为牙髓活力测试阳性。目前报道成功的病例大多数达到初级或二级目标，少数达到三级目标，临床表现评价分别为患牙的临床症状消失，根尖周病变愈合；牙根继续发育包括根管壁增厚、牙根增长、根尖孔缩小[6-9]；甚至有部分患牙恢复牙髓活力，临床检查表现为牙髓电活力测试(electric pulp testing，EPT)阳性[10-12]。

目前已知根管治疗后根尖周组织的愈合方式有5种：①由新生牙骨质或骨样组织使根尖孔封闭；②根尖孔处有瘢痕组织形成；③健康的纤维结缔组织或骨髓状的疏松结缔组织充满根尖区；④根管超充填者，由纤维组织囊包围；⑤牙槽骨增生与根尖部相连而成骨性愈合，5种愈合方式均为组织学检查结果，因此REPs的治愈效果还欠缺组织学层面的评价。REPs动物模型的组织学检查显示，根管壁上新形成的硬组织为牙骨质样[13-15]、骨样[15]和牙本质样组织[16]，根管内形成的软组织为牙周膜样组织[14-15]，甚至为含成牙本质细胞层的牙髓样组织[16]。由于严格的伦理限制和多重考虑，人的年轻恒牙经REPs后的组织学检查病例十分有限，但却为后续研究提供了重要证据。本研究的目的是在有限的病例报道中，对年轻恒牙经REPs后的临床结果包括临床检查和影像学检查与组织学结果做一描述性系统评价。

1 资料与方法

1.1 纳入和排除标准

本系统评价的纳入标准是英语的、人的、有REPs的年轻恒牙，有临床检查结果和对根尖软硬组织有组织学评价的研究，排除标准是其他语言的、动物的、细胞的和对成熟恒牙的或对年轻恒牙但没有临床检查和组织学检查的人的研究。

1.2 文献检索

在MEDLINE和Web of Science数据库进行电子检索，采用以下关键词：

(histological OR histology) and (revascularization OR regenerative endodontics OR regeneration OR regenerative endodontic treatment OR regenerative endodontic procedure) and (immature teeth OR open apex)。检索文献起自1965年，2019年12月31日前完成最后一次检索。

1.3 文献筛选

所有文章的标题和摘要先后由两位作者独立筛选后相互核对，不符合纳入标准的被排除，然后对剩下的文章进行全文评价，如有异议，将由第三作者决定是否被纳入。

1.4 数据提取和文献质量评价

提取文献中的作者、年份、患者年龄和性别、术前诊断、治疗过程、拔牙原因和时间、临床结果和组织学检查结果等。对纳入的病例研究采用英国国家优化卫生与保健研究所(National Institute for Health and Care Excellence，NICE)推荐的病例系列评价量表进行质量评价。

1.5 结果合成

由于纳入的研究均为病例报道，无随机对照试验，治疗过程、临床检查和以及组织学检查结果方法差异大，异质性大，难以使用定量的Meta分析，故本文只进行定性的系统评价。

2 结 果

2.1 检索结果

通过两个数据库的电子检索，一共搜索到265篇文章，通过两位作者的筛选，首先排除动物研究72篇，排除回顾性研究37篇，对剩下的研究里排除细胞研究和成熟恒牙的研究及年轻恒牙但没有组织学检查的研究140篇，最终有16篇文章达到了纳入标准[11-12,17-30]，这些研究均进行了详细的组织学分析，7篇文章还包括免疫组织化学分析。

2.2 文献质量评价

本文纳入的16篇文献采用NICE推荐的病例系列评价量表进行质量评价，包括以下内容：①案例是否源于多个治疗中心；②研究目标是否描述清晰；③纳入标准和排除标准是否描述清晰；④对报道的结果的定义是否明确；⑤是否进行前瞻性研究；⑥患者是否被连续招募；⑦主要发现是否清晰描述；⑧是否对结果进行分层分析。每项作出“是”或“否”的判定，分别计1或0分，然后合计评分。总分为 8 分，8 ～ 4 分为高质量，4 分以下为低质量。 本文最终1个3分，14个4分，1个5分，即15篇高质量文献，1篇低质量文献。

2.3 纳入研究的基本特征

2.3.1 性别 本文纳入的25颗患牙中，患者性别分别为，11男，13女、1未知，经REPs后，治疗失败的2位患者[22,28]性别为1男[22]、1女[28]。

2.3.2 牙位和年龄 本文纳入的25颗牙中，包含了9颗切牙、15前磨牙和1磨牙。这些病例中，1位患者年龄未知，1位患者年龄为29岁，其余23位患者年龄在6～13岁。一般来说，上颌中切牙在7～8岁萌出，上颌侧切牙在8～9岁萌出，上颌第一前磨牙在10～11岁萌出，上颌第二前磨牙在10～12岁萌出，下颌第二前磨牙在11～12岁萌出，第一磨牙在6～7岁萌出。因此，纳入的25颗牙中，除1位患者年龄未知，1颗牙[27]在萌出10年以上才接受治疗，其余牙都是在萌出后3年内接受治疗。

2.4 治疗结果

2.4.1 临床结果和影像学结果 本文纳入的25颗牙中，2颗牙[22,28]失败，根尖周病变持续存在、未见明显的牙根继续发育，即未达到AAE评价的初级目标；2颗达到初级目标[17,28]，即临床症状消失、根尖周病变愈合；16颗牙在初级目标的基础上达到二级目标[18-19,21,23-30]，可见牙根继续发育；5颗牙在二级目标的基础上达到三级目标[11-12,20,29-30]，能检测到牙髓活力。

2.4.2 组织学结果 本文纳入的所有病例均进行了组织学检查，7篇文献[11-12,17-18,23,28,30]包括10颗牙还进行了免疫组织化学检查，2篇文献[22,28]包括4颗牙进行了细菌染色。

临床失败的2颗牙[22,28]其失败原因和肉芽肿组织存在及感染未彻底控制有关，其中1颗牙[28]的组织学检查发现根尖段根管壁上仍有硬组织沉积，根管内可见修复性结缔组织，根尖可见肉芽肿，但其革兰染色未发现细菌；而另1颗患牙[22]可见牙根外吸收，部分吸收区见骨样或牙骨质样组织沉积，根管内可见炎症细胞、坏死碎片和细菌生物膜。

达到AAE评价初级目标的2颗牙中，1颗牙[17]根管内可见修复性结缔组织且无炎性细胞，未见感染且有成牙本质细胞层，却未见牙硬组织形成，可能与其观察时间仅达3.5周有关，考虑到AAE建议REPs术后的观察时间为6个月以上，后续未对该病例进行分析。另1颗牙[28]根管内为无成牙本质细胞的结缔组织，但其免疫组织化学检查发现根管内软组织神经丝(neurofilament，NF)+(较正常牙少)。

达到AAE评价二级目标的16颗牙中，1颗牙[25]的根尖段可见新的牙本质样组织形成且根尖段可见成牙本质细胞；1颗牙[23]作者认为有第三期牙本质形成，免疫组织化学显示骨钙素(osteocalcin，OCN)+，根管内软组织NF+，但无牙本质细胞形成；剩余14颗牙[18-19, 21, 24, 26-30]新形成的组织为牙骨质样或骨样组织，软组织也缺乏成牙本质细胞，大多数根管内可见营养不良性钙化，其中有3颗牙做了免疫组织化学染色，分别显示骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)+、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)-、NF-[18]和Ⅲ类b-微管蛋白(class Ⅲ b-tubulin，TUBB3)+、施万细胞的标志物(S100)+(与痛觉感受器标志物降钙素生成肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)不能实现共定位)、OCN+、DSP-[30]以及根尖乳头NF+[28]。

达到AAE评价三级目标的5颗牙中，有2颗牙仅有软组织的组织学检查，其中1颗牙[12]与正常牙髓相似，可见成牙本质细胞，且其免疫组织化学显示神经元标志物(neuronal marker，NeuN)+，1颗牙[20]则为缺少典型的成牙本质细胞层的结缔组织；另外3颗包括硬组织和软组织的组织学检查中，仅1颗牙[30]有新的牙本质和成牙本质细胞形成，其免疫化学组织检查显示TUBB3+、S100+、新形成硬组织OCN+、DSP+，其余2颗牙[11,29]根管壁上新形成的为牙骨质样组织，根管内无成牙本质细胞形成，其中1颗牙[11]做了免疫组织化学检查，显示神经纤维标志物蛋白基因产物9.5(protein gene product 9.5，PGP9.5)+、成牙本质细胞标志物巢蛋白(nestin)-。

3 讨 论

为全面分析评价年轻恒牙REPs的治疗结果，包括临床结果(包括影像学结果)和组织学结果，本文通过文献的纳入和排除，总共有16篇文献纳入研究。纳入的研究均为病例报道研究，无随机对照研究，治疗结果会有较大的误差；另外，本文仅选择已发表于有限的数据库中的英文文献，存在着一定的发表偏倚。16篇文献里，共计25颗牙纳入，其中有1颗牙因观察时间太短仅3.5周，治疗结果难以评价，故不纳入后续讨论。

3.1 牙根继续发育的组织学特征

本文纳入分析的24颗牙中，共有21颗牙的影像学检查表现出牙根继续发育，即达到AAE评价的二级目标或三级目标。然而组织学检查发现，仅2颗牙[25, 30]有新的含牙本质小管的牙本质样组织形成和排列整齐的成牙本质细胞层形成；另外1颗牙[12]也有成牙本质细胞层形成，但由于该患者未拔牙，只有软组织的组织学检查结果。剩余18颗牙均无成牙本质细胞层和牙本质样组织形成，其中有17颗牙的根管壁沉积的组织为牙骨质样和骨样组织，且牙骨质样组织较为多见，另外1颗牙[23]其作者认为是有第三期牙本质形成，但其免疫组织化学仅显示OCN+，未行DSP染色，考虑到牙骨质和骨组织均表现为OCN+，无法确定新形成的硬组织为牙本质。从目前的结果看，导致患牙在影像学表现为牙根继续发育的原因是牙本质、牙骨质和骨样组织的沉积，其中多为牙骨质样和骨样组织沉积，而较少发生的牙本质样组织形成往往伴随成牙本质细胞层的形成[25, 30]。该部分结果提示，REPs的术后愈合机制大部分与根管治疗后根尖周组织的愈合机制相似，仅少数病例有新生牙本质形成。

3.2 牙髓活力测试阳性的组织学特征

本文纳入分析的24颗牙中，有5颗牙[11-12,20,29-30]达到三级目标，牙髓活力测试阳性，其中3颗牙[11-12,30]的免疫组织化学检查结果分别显示PGP9.5+、NeuN+以及TUBB3+和S100+，均表明有神经再生，另外2颗牙未行免疫组织化学检查。除了这5颗牙之外，还有3颗牙[23,28,30]仅达到AAE评价的二级目标(1颗牙髓活力测试阴性，2颗未行牙髓活力测试)，但免疫组织化学检查显示可能有神经再生，表现为根管内软组织NF+[28]、牙髓样组织NF+[23]、TUBB3和S100+(但与CGRP不能实现共定位)[30]。由此可见，达到AAE评价的三级目标的患牙，其组织学检查往往能发现神经再生，而达到二级目标的部分患牙，组织学检查仍可发现神经再生。考虑到牙髓电活力测试是评估牙髓中的Aδ神经纤维的完整性，它与牙釉质和牙本质的厚度以及牙髓中神经纤维的数量有关[31]。而在REPs中，再生牙髓样组织常位于釉牙骨质界的根方，其上方又常有较厚的生物盖髓材料和充填材料覆盖，牙髓电活力测试存在出现假阴性结果的可能。从目前的结果看，即使AAE评价结果为二级的病例，其组织学上也可能有神经再生，因无法利用组织学检查判断是否有神经再生，其检测方式仍有待改善。有研究[32]采用多普勒血流仪来判断牙髓组织是否有血管再生，结果发现伴随牙髓活力测试阳性的恢复，血流量也有所恢复，提示血流量的检测可以作为判断牙髓活力状态的补充，但同样存在假阴性结果的可能。

3.3 牙髓、根尖周组织的术前状态对结果的影响

本文纳入分析的24颗牙，其牙髓、根尖周组织的术前状态各异，其中8颗[24,29]牙完全健康；4颗牙[25,28]牙髓部分坏死但根尖周有病变；1颗牙[19]的近中根牙髓部分坏死，远中根牙髓坏死；10颗牙[11,18,20-23,26,27,30]牙髓坏死且伴有根尖周低密度影,1颗[12]未知。

活髓且根尖周健康的患牙即8颗完全健康的牙中，7颗[24,29]达二级目标，1颗[29]达三级目标，且8颗牙的组织学检查均未发现牙本质和成牙本质细胞形成；除1颗未知外，其余15颗牙牙髓根尖周有病变的患牙中，2颗牙[22,28]治疗失败；1颗[28]达初级目标；9颗牙达二级目标且其中2颗[23,30]免疫组织化学检查有神经再生、1颗[25]根尖段见新的牙本质样组织和成牙本质细胞形成；3颗牙[11,20,30]达三级目标且其中1颗[30]组织学检查发现牙本质样组织和成牙本质细胞形成。

从上述结果看，两种术前状态(健康牙髓和牙髓坏死根尖周病变)均可获得组织学上的牙本质或牙髓的再生，但根尖周有病变的患牙更容易出现治疗失败的情况。细胞归巢被定义为在生物信号分子的作用下，招募内源性干细胞或祖细胞至某个结构内，以达到组织的修复或再生[33]。REPs中，细胞归巢主要是招募内源性细胞包括干细胞/祖细胞到根管内[34]，这些细胞包括根尖乳头细胞干细胞[35-36]、牙髓干细胞[37-38]、骨髓间充质干细胞[39]。因此，根尖周即使存在病变也可获得组织学上的再生，可能与根尖周组织的存活细胞或血液来源的干细胞有关，而感染程度并非决定性因素。

3.4 治疗过程对结果的影响

3.4.1 次氯酸钠冲洗液 24颗牙中除1颗[12]未知，剩余23颗牙使用的冲洗液为1.00%～5.25%的次氯酸钠(sodium hypochlorite，NaClO)溶液，使用低浓度1.0%～1.5% NaClO溶液的12颗牙中，达到初级、二级、三级目标的牙数分别为1颗、9颗、2颗，所有牙均无牙本质和成牙本质细胞形成，包括2颗牙显示有神经再生。使用中等浓度2.5%～3.0% NaClO溶液的5颗牙中，失败1颗，达二级目标4颗，均无牙本质和成牙本质细胞形成。使用高浓度5.25% NaClO溶液的6颗牙中，失败1颗，达二级、三级目标的牙数分别为3颗、2颗，其中有2颗组织学评价见牙本质样组织和成牙本质细胞层形成。

从临床结果看，使用不同浓度的NaClO溶液冲洗根管对治疗效果可能影响较小。但从组织学结果看，似乎高浓度处理更容易形成牙本质细胞和牙本质样组织。这和AAE操作指南上建议使用1.5%浓度NaClO进行冲洗的建议有出入，考虑到高浓度NaClO主要表现为组织溶解性和灭菌性能，及其对根尖周组织的毒性[40]，如能有效控制感染，高浓度NaClO的使用对于最终临床结果并非必要。

3.4.2 EDTA冲洗液 REPs最后一次使用的冲洗液多为17%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，有17颗牙[11,23-24,26-30]，其次为生理盐水或NaClO溶液有6颗[18-22,25]。使用17%EDTA溶液冲洗的17颗牙中，失败1颗，达初级、二级、三级目标的牙数分别为1颗、12颗、3颗，其中有3颗牙[23,28,30]免疫组织化学检查显示神经再生，1颗牙[30]见牙本质样组织和成牙本质细胞。使用其他冲洗液的6颗牙，失败1颗，达二级目标4颗，达三级目标1颗，其中1颗牙[25]可见牙本质样组织和成牙本质细胞。

有研究显示，高浓度的NaClO溶液和三联抗生素糊剂(triple antibiotic paste，TAP)对根尖周干细胞的生存、增殖和分化有一定抑制作用[41-42]，而17% EDTA可减少NaClO的毒性[40]，并且17% EDTA使用，尤其与NaClO溶液配合使用时[43]，能促进牙本质内的生长因子释放，同时17% EDTA可促进牙髓干细胞对牙本质的粘附、迁移和分化能力[44-45]。因此，尽管从临床结果和组织学结果看，刺激根尖出血前是否使用17%EDTA溶液冲洗影响有限，但AAE操作指南仍然建议在引血前用17%EDTA冲洗根管。

3.4.3 诊间封药

除了有8颗[24,29]完全健康的牙一次性完成REPs而未用诊间封药、1颗[12]未知外，7颗牙采用氢氧化钙糊剂[18,22,27-28,30]，8颗牙采用TAP/二联抗生素糊剂(double antibiotic paste，DAP)[11,19-21,23,25-26,30]。使用氢氧化钙诊间封药的7颗牙中，失败2颗，达初级目标1颗，达二级目标4颗，其中2颗组织化学染色可见神经再生。使用TAP/DAP的8颗牙中，达二级目标5颗，达三级目标3颗，其中1颗染色见神经再生，2颗见牙本质样组织和成牙本质细胞。

从临床结果和组织学结果看，似乎TAP/DAP诊间封药拥有更高的成功率和更好的治疗效果，这可能与TAP/DAP抗感染能力更强有关[46]。

3.4.4 干细胞和支架 技术方面，仅Xuan等[12]采用自体牙髓干细胞移植、血凝块为支架的方法而达三级目标且有与正常牙髓组织相似的含成牙本质细胞样组织形成外，其余23颗牙均采用诱导根尖周干细胞迁移或根尖残髓增殖分化的方法。采用单纯血凝块为支架的患牙有14颗牙[11-12,17-18,21-24,26,28-30]，采用复合血凝块(胶原+羟基磷灰石+血凝块)的有4颗牙[29]，而采用富含血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)、富含血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)的患牙仅2例[20,27]，1例[19]的近中根使用血凝块而远中根使用血凝块和PRP，而未能刺激根尖出血而无支架有2颗牙[25,30]。

以血凝块为支架的14颗牙中，失败2颗，达初级、二级、三级目标的牙数分别为1、8、3颗。达二级目标的8颗牙均无成牙本质细胞和牙本质样组织形成；达三级目标的 2颗牙组织染色均显示有神经再生，且有1颗牙根管内可见成牙本质细胞和牙本质样组织形成。

使用胶原-羟基磷灰石+血凝块的4颗牙[29]，均为完全健康的牙，其根管消毒方法和支架置入方法都完全一样，临床结果却不一样，有1颗牙牙髓活力测试阳性，达到三级目标，另外3颗牙达二级目标；但4颗牙的组织学结果均相似，即根管内软组织为无炎症的、不含成牙本质细胞的疏松结缔组织，沉积硬组织为牙骨质样组织。

使用PRP、PRF的2颗牙中，1颗[20]达三级目标，组织学检查仅对软组织进行了评价，未发现成牙本质细胞样细胞形成；而另1颗[27]达二级目标，组织学检查仅对硬组织进行了评价，显示仅有细胞样牙骨质沉积。

无支架的2颗牙经REPs后，均达二级目标，但组织学检查发现，其中1颗牙[25]见典型的牙本质样组织和成牙本质细胞样细胞形成；另1颗牙[30]发现骨样组织沉积、无成牙本质细胞样细胞形成，免疫组织化学检查发现有神经标志物的形成。

有趣的是，有作者在同1颗牙(46牙)[19]分别在近中根使用血凝块、远中根使用PRP，其余处理条件完全一样，最终获得的临床结果和组织学结果没有差别，表现为根尖周病变均愈合，根管壁沉积硬组织均为牙骨质样组织，软组织均为结缔组织且未发现成牙本质细胞。

研究显示，血凝块、PRP、PRF均能释放生长因子，促进干细胞的增殖、迁移和分化[47]，从目前仅有的结果看，这些方法对临床和组织结果影响不大，均被AAE建议。

3.5 随访时间

AAE建议患者术后6、12、24个月随访，通常在前两次就诊期间临床症状消失，6～12个月后可发现根尖周病变愈合，12～24个月后可观察到牙根继续发育。因此，短期时间内，牙根继续发育不明显，例如本文纳入的1颗牙[17]，仅有3.5周随访时间，虽然没有硬组织形成，但其根管内可见排列整齐的成牙本质细胞层，若随访时间延长，可能会有牙本质或其他硬组织形成。同时，短期随访时间也可能会有一些症状不会表现出来，例如治疗失败的这颗牙[22]，12个月都未出现症状，根尖周也未见明显病变。

从本文纳入的研究看，对于根尖周发生病变的病例，最早出现初级目标的是1个月[21,27,30]，最早出现二级目标的是3个月[25,29]，最早达到三级目标的是5个月[30]。因此，建议患者在术后1和3个月也要随访观察，同时在第二次随访(3个月)开始检查患牙牙髓活力情况。

3.6 患牙萌出后时间

年轻恒牙是指根尖未完全发育完整的年轻或新萌出恒牙，一般恒牙萌出后需要经历3年或更长时间才能使牙根发育完全[48]。年轻恒牙在发育过程中易受到创伤、龋坏以及发育异常的影响，使牙根停止发育，其治疗时间则可能超过萌出后的牙根形成的关键时期。在治疗时间远远超过年轻恒牙萌出3年的病例当中，有患者20岁[49]、44岁[50]时仍获得了REPs的成功，所以治疗时患牙萌出后时间或许并不是一个决定性因素，而只是个影响因素。本文纳入的25颗牙中，除1例患者年龄未知，1颗牙[27]在萌出10年以上才接受治疗，其余牙都是在萌出后3年内接受治疗。结合临床结果和组织学结果看，达三级目标或免疫组织化学显示神经再生的患牙为2颗[28,30]中切牙(6岁和8岁)、1颗[20]上颌前磨牙(11岁)和4颗下颌第二前磨牙(3颗10岁、1颗12岁)，显示有牙本质和成牙本质细胞层的患牙为2颗[25,30]下颌第二前磨牙(10岁和11岁)，这些牙均在萌出后1年内接受治疗。而唯一的1例29岁患者，经REPs后达二级目标，组织学检查无牙本质样组织和成牙本质细胞形成，硬组织为有细胞牙骨质样组织。目前的结果提示越早接受治疗有利于更佳的临床及组织学效果，而成年后行REPs也并非禁忌证。

4 小 结

年轻恒牙经REPs后，往往能取得临床上的成功，牙根继续发育的实质多为牙骨质样和骨样组织沉积，少数为牙本质的形成，而有牙本质的形成则往往伴有成牙本质细胞的形成；同时，牙髓活力的恢复往往伴有神经的再生。而目前的研究均为少量病例报道，今后仍需前瞻性队列研究，以便对不同的术前状态、不同的消毒方案、不同的细胞技术及支架的影响进行评价，调整治疗方案以达到牙髓-牙本质复合体真正意义的再生。