GSK-3β对BMSC生物学性能调节机制的研究进展*

黄润语 杨文悦 刘加强

糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β），是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与众多相关的信号通路［1］。在干细胞中，调控GSK-3β能影响神经细胞发育［2］、心肌缺血损伤［3］等重要生命进程。GSK-3β也参与骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）的骨生成性能的调控，影响细胞成骨向分化、细胞归巢和细胞增殖等重要环节。BMSC因具有低免疫源性、多向分化能力和较强的增殖能力，被认为是骨组织工程技术中种子细胞的理想选择。近年来，关于GSK-3β对BMSC骨生成性能的调节机制的研究越来越多，以期为解决临床问题提供新方法。故本文结合文献就GSK-3β对BMSC生物学性能调节机制的研究进展作一综述。

1.GSK-3β的性质

GSK-3β为一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）家族。GSK-3最早由于参与糖原代谢和胰岛素信号通路而被广泛研究，现今对于它的认知更加完善，已知GSK-3参与糖原代谢、细胞增殖、细胞凋亡等多种生理过程［4］。在哺乳动物中，GSK-3存在两种同工型，GSK-3α与GSK-3β。它们的激酶结构域高度同源，但在N端与C端存在差异［5］。目前对GSK-3α的研究较少，而GSK-3β因其在经典Wnt通路、磷脂酰基醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatidyl-inositol 3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt）通路和Notch通路等有关细胞增殖和分化的通路上而受到关注［6］。GSK-3β的底物数量庞大，对这些底物位于C端的氨基酸残基进行预磷酸化处理后GSK-3β才可识别它们［7］。

GSK-3β的活性主要取决于激活位点酪氨酸-216（Tyr-216）与失活位点色氨酸-9（Ser-9）之间磷酸化水平的平衡。在BMSC迁移过程中，基质细胞衍生因子-1（stromal derived factor-1，SDF-1）和细胞膜趋化因子受体4（C-X-C motif receptor 4，CXCR4）能够通过PI3K/Akt信号通路使N端的Ser-9磷酸化从而失活GSK-3β，激活下游调控因子，促进细胞迁移。此外，GSK-3β还存在其他的磷酸化位点能够调控其自身活性，例如p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）磷酸化苏氨酸-390（Thr-390）后，能使GSK-3β活性下降并激活靶基因Wnt。除磷酸化调控之外，GSK-3β的活性还受蛋白复合物结合、底物特异性、亚细胞定位以及蛋白酶切割等多种过程的影响［8］。

2.GSK-3β对BMSC生物学性能的调节机制

2.1 GSK-3β与 归 巢GSK-3β所 在 的SDF-1/CXCR4/GSK-3β/β-catenin信号通路与自体BMSC归巢有关［9，10］。BMSC表面高度表达的CXCR4，能与损伤或缺血的组织释放的SDF-1结合，活化P13K/Akt信号通路而增加BMSC的迁移［11］。活化的Akt能磷酸化GSK-3β，从而阻碍GSK-3β与β-catenin形成复合物，使得胞质内β-catenin含量增多，最终导致细胞增殖能力增加和促进细胞归巢［12］。

抑制GSK-3β能明显提升MSC的迁移能力。用氯化锂直接降低细胞中GSK-3β活性，会引起基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表达增多［13］。MMP-9能降解细胞外基质而提升移动性能［14］。Kim YS等学者的体外扩增研究中发现，在GSK-3β下调时，Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子7（Rho guanine nucleotide exchange factor 7，ARHGEF7，又称为β-PIX）和CXCR4增多，从而推测GSK-3β通过β-catenin/c-Raf/ERK/β-PIX通路参与hBM-MSC迁移［15］，而GSK-3β调控CXCR4/SDF-1轴的机制仍有待研究。在小鼠大脑中，敲减β-PIX的MSC的迁移水平明显降低，显示β-PIX会影响MSC迁移［16］。

在细胞缺乏GSK-3β时，细胞迁移会以低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1alpha，HIF-1α）依赖的方式进行。在Flügel D等学者的研究中，GSK-3β-/-细胞在迁移水平上明显高于GSK-3β+/+细胞。并且，由于转染shRNA抑制HIF-1α后，GSK-3β-/-在迁移水平上的变化消失，可知细胞的迁移离不开HIF-1α的调控［17］。Udartseva OO等学者在低剂量光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）提升MSC的成血管潜能研究中，也证实了GSK-3β下调和MSC所分泌的多种不同的促血管生成因子增多（例如VEGF-A、MMP-9、IL-8、PAI-1等）以及MSC迁移能力提高的相关性［18］。

2.2 GSK-3β与增殖 在骨生成过程中，BMSC在微环境中的存活和增殖能力决定了修复速度和愈合效果。GSK-3β被锂及其他特异抑制剂致失活后，BMSC增殖能力提高［19］。若使用β-catenin/T细胞转录因子（T cell transcription factor，TCF）通路抑制剂或小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制β-catenin，这种变化会消失。故GSK-3β依赖的经典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路介导了MSC的增殖过程。在此通路中，失活的GSK-3β解除对β-catenin的抑制作用，β-catenin入核与TCF/淋巴增强因子（lymphoid enhancer binding factor，LEF）结合，激活靶基因，例如c-Myc和cyclin D1，从而影响细胞增殖［20］。

c-Myc的表达水平与细胞增殖紧密相连，在不同细胞中存在促增殖或抑增殖的双重作用。Svitlana等人的研究证实了MSC中c-Myc的表达能够提高细胞增殖水平［21］。其主要通过调控编码细胞周期正向或负向调节蛋白的靶基因而影响细胞周期进程。通过转染或逆转录使c-Myc强制表达后，静止细胞进入细胞周期；而c-Myc的下调或失活会使细胞周期进程受阻［22］。Gregory等人的研究也显示了用锂抑制GSK-3β的活性后，c-Myc的稳定性增加，其在N端的Thr-58位点的磷酸化受抑，进一步印证了GSK-3β对c-Myc水平的负向调控作用c-Myc的表达水平在胞内受到精细调控，GSK-3β也参与其中［23］。静息状态下，c-Myc的Thr-58位点被GSK-3β磷酸化，促使c-Myc经泛素途径迅速蛋白酶解；而当细胞受到丝裂原刺激后，c-Myc合成增加的同时，Ras被激活，经Ras/Raf/MEK/ERK途径，最终ERK介导c-Myc的Ser-62位点的磷酸化以使c-Myc在胞内水平保持稳定。此外，Ras激活后也能通过PI3K/Akt途径抑制GSK-3β对Thr-58的磷酸化作用，c-Myc蛋白酶解减少，进一步增加并稳定其在胞内的水平，从而发挥上述对细胞周期的推进作用。

细胞受丝裂原刺激后，cyclin D1作为调节亚基与周期蛋白依赖性激酶4/6（cyclin dependent kinases 4/6，CDK4/6）结合形成复合体，介导Rb蛋白（retinoblastoma protein，Rb protein）磷酸化，最终释放转录因子E2F。E2F诱导靶基因表达，使细胞通过限制点进入S期。GSK-3β被抑制剂致失活后，cyclin D1表达水平及S期细胞比例显著增高［20］。GSK-3β一方面如上文所述在经典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路中调控cyclin D1基因的表达，另一方面能够直接磷酸化cyclin D1而使其降解。Diehl等人的研究显示GSK-3β能够特异性磷酸化cyclin D1的Thr-286位点，致使核输出蛋白1（exportin 1，XPO1）介导cyclin D1出核而重新定位至胞质，进入蛋白酶解途径。因此，细胞周期中cyclin D1的磷酸化与其亚细胞定位是通过GSK-3β联系在一起的［24］。但与之相矛盾的是，也有研究显示通过特异性抑制剂使GSK-3β失活后，cyclin D1在Thr-286的磷酸化水平未受影响［25］。由此，关于GSK-3β对cyclin D1的磷酸化作用目前尚无定论，有待进一步研究。

2.3 GSK-3β与凋亡GSK-3β主要通过活化促凋亡转录因子来促进BMSC的凋亡。结合上文可以得出，在骨生成过程中，调节GSK-3β的活性水平能影响BMSC的数量和效能。

以Bcl-2蛋白中的促凋亡转录因子Bax为例，GSK-3β能够通过直接磷酸化活化Bax，而当Bax的被磷酸化区域发生突变，则不能完成线粒体转运，从而其构象无法转变至活化状态［26］。

以促凋亡转录因子p53为例，有研究认为GSK-3β对凋亡有促进作用。其机制为GSK-3β能够直接磷酸化p53的33位丝氨酸并介导p53的315和376位丝氨酸的磷酸化过程，并且除了这种直接作用，GSK-3β还能通过磷酸化p53特定的E3泛素连接酶MDM2以调节p53的水平，阻碍p53与MDM2的相互作用，从而抑制MDM2介导的泛素化，减少p53的蛋白酶解［27］，激活p53介导的凋亡途径。但也有研究认为GSK-3β能够抑制p53的活化，对凋亡有抑制作用。其机制为GSK-3β能够负反馈调控其下游的信号分子β-catenin，在GSK-3β水平较低时，β-catenin则会大量表达，由此通过阻断MDM2依赖以及非MDM2依赖的细胞退行性变途径来增加p53的基础水平。但是高水平的GSK-3β则有相反作用［28］。

以上关于GSK-3β与p53对于凋亡作用的研究角度不同，得到的结果也不同。p53与GSK-3β之间的关系显然还需要多角度的研究以获得更深入、更全面的理解。

此外，在NF-κB信号途径中，GSK-3β则是一种促生存激酶。研究发现，纯合性缺失GSK-3β的小鼠由于促凋亡信号TNF而导致肝功能损伤，最终在E13.5之前死亡。这显示了GSK-3β能够抑制一种TNF依赖的细胞凋亡途径［29］。

2.4 GSK-3β与成骨分化和成软骨分化GSK-3β可通过多个途径影响与骨生成相关的细胞的分化，如BMSC的成骨方向分化、成骨细胞系的成骨方向分化和BMSC的成软骨方向分化等。前二者主要由Wnt/β-catenin通路调控，后者则涉及NF-κB信号通路。

抑制GSK-3β能促进拥有成骨分化潜能和成脂分化潜能的间充质祖细胞分化为成骨细胞［30］。Wnt/β-catenin通路中，GSK-3β表达下调或GSK-3β磷酸化失活会使β-catenin因降解减少而浓度增加，稳定的β-catenin进入细胞核，激活靶基因，促进BMSC的成骨向分化。GSK-3β可弱化Runx2和Osterix的表达，负向调控BMSC的成骨分化［31］。Runx2高表达于创伤愈合早期，能在早期促进BMSC成骨分化，而在晚期抑制分化［32］；Osterix则是成骨细胞特异性转录因子，在BMSC向成骨方向分化中起决定性作用。

此外，抑制GSK-3β还能促进BMSC的成软骨分化。有学者利用白介素-1β（IL-1β）刺激诱导炎症环境，并采用氯化锂抑制GSK-3β，研究此时BMSC的成软骨分化情况，发现在GSK-3β信号受抑制的情况下，NF-κB蛋白的磷酸化水平和入核能力降低，从而抑制了NF-κB通路，进而增强了BMSC在IL-1β诱导炎性环境下的成软骨能力［33］。

3.小结

GSK-3β为一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，在BMSC的归巢、增殖、凋亡和成骨向分化等环节中，为参与相关信号通路的重要蛋白，其所在的经典Wnt/GSK-3β/β-catenin通路是最关键的通路，可通过调控c-Myc、cyclin D1、Bax和p53影响细胞活性，而Runx2和Osterix等Wnt/β-catenin/TCF的靶基因，则可被GSK-3β弱化表达而影响成骨向分化。此外，结合文献发现，对骨分化进程的影响的研究，更多的在于GSK-3β对成骨细胞系的成骨方向分化和破骨细胞系的破骨细胞方向分化的影响。

总体上，负调控GSK-3β的活性水平，可促进BMSC骨生成，这已在多项体内、体外研究中通过锂离子或特异抑制剂证实［34，35］。不过，在体外实验研究中发现，对于不同病理状态的啮齿动物模型，GSK-3β对骨生成的影响不一致［32］。一方面，说明了GSK-3β的活性变化及其效应可能不够稳定和显著。鉴于GSK-3β位于相互交联的多个信号通路，上下游蛋白受其影响者众多，实验结果为多方综合的效果，需要更多精细设计的研究厘清。另一方面，这可能与各个研究使用的动物种类、抑制剂种类、抑制时间长短不同等因素有关。

在使用骨组织工程技术修复骨缺损的过程中，支架上的种子细胞在进行骨生成，为获得更理想的修复效果，可通过诱导自体BMSC归巢，增加缺损部位的细胞数量并增强修复功能［36］。在骨生成过程中，BMSC在微环境中的存活和增殖能力也决定了修复速度和愈合效果。通过负调控GSK-3β的活性水平，可影响BMSC这些重要性能，因此可作为促骨修复的策略参考之一。