放化疗性口腔黏膜炎动物模型研究进展

邹晓龙， 陈媛， 王艳， 王建涛

1.口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院，四川 成都（610041）；2.生物治疗国家重点实验室 四川大学华西医院肺癌中心 四川大学华西医院放疗中心，四川 成都（610041）

放疗诱发的口腔黏膜炎（radiotherapy-induced oral mucositis，RTOM）和化疗诱发的口腔黏膜炎（chemotherapy-induced oral mucositis，CTOM）严重影响患者的生活质量，可导致患者疼痛、说话吞咽困难，以及局部和全身感染风险增高，甚至中断治疗进而影响抗癌治疗效果［1］。目前主要认为放化疗性口腔黏膜炎发病过程如下：最先涉及放疗或化疗对细胞的初始损伤，这种损伤可直接通过DNA 损伤或者产生活性氧物质间接导致；随后各种酶和转录因子的作用导致肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 等炎性细胞因子的上调，作用于黏膜下层和基底细胞上皮细胞；炎症和组织损伤导致溃疡和细菌定植，并进一步加重炎性细胞因子介导的损伤；最后愈合阶段由细胞外基质发出信号促使上皮细胞增殖，形成上皮以及重建黏膜屏障［2］。但目前关于口腔黏膜炎的发病机制尚未完全阐明，对其治疗也仅为对症治疗［3-4］。动物模型作为生物医学研究中不可或缺的工具，在探究口腔黏膜炎的发病机制以及探索更好的防治方法中起到了至关重要的作用，本文就放化疗性口腔黏膜炎动物模型的研究进展予以综述，以期为相关研究提供动物模型参考。

1 RTOM 动物模型复制方法

1.1 实验动物

目前国内外多采用啮齿类动物来复制RTOM动物模型，啮齿动物具有体型较小、饲养繁殖方便、遗传背景清晰及品种品系多等优势，因此成为了实验动物的首选。1983 年Parkins 等［5］首次选用近交系小鼠复制模型。目前文献报道多采用8～14 周的近交系小鼠C3H［1，3，6-10］、Neu［1，3，6-9］、HeJ［10］、BALB/c［11-12］、C57Black/6［13-14］、BDF-1［15］等 复 制RTOM 动物模型，小鼠动物模型有着体型小，繁殖迅速，饲养相对廉价，寿命长达2～3 年，与人类有许多生理和分子相似性，以及完全测序的基因组等优势，但是由于照射小鼠鼻部时大脑不可避免地也被照射，以及多次麻醉等原因经常导致实验动物的死亡；也有研究者采用Sprague-Dawley 大鼠等复制模型［16-17］，和小鼠相比，大鼠体积较大，造模操作相对简便；少数研究者则选择了金仓鼠作为实验对象［18］，严重的RTOM 在小鼠模型中诱导体重减轻和全身状况恶化，而金仓鼠颊囊中产生的黏膜炎不影响食物摄入和体重，但是金仓鼠颊囊为免疫豁免区，因此不能提供准确的免疫反应。

1.2 实验方法

1.2.1 单纯X 射线照射诱导法 目前文献报道的RTOM 动物模型复制方法常采用X 射线设备照射。根据构建动物模型时X 射线照射部位分为局部照射和全身照射，根据照射方式分为单剂量照射和分割照射。Kowaliuk 等［6］采用雄性的C3H 及Neu 小鼠作为实验对象，投照剂量率为3 Gy/min，照射剂量为（11.8±1.4）Gy，对小鼠进行单次照射，小鼠麻醉后仰卧于35 ℃预热的铝块上，1 mm 厚的铝板开出（3×3）mm2的小孔以确定照射区域，用镊子将鼠舌拉过小孔并用胶带固定，舌头其他区域和身体用铅屏蔽。此外，该小组还采用了经小鼠鼻部分割照射的方法，将小鼠引导到有机玻璃管（内径28 mm）中，管前端用锥形管固定小鼠，关闭管后盖防止小鼠逃逸，投照区域为头部，包括整个舌体，身体其他部位都被铅有效保护，并控制每个小鼠鼻部照射区域之间的剂量差异在3%以内，剂量率为1 Gy/min，照射剂量为3 Gy/次，1 次/d，每周5 次，持续照射1～2 周。有文献提出仅对小鼠进行1～2 周的分割照射并不会使RTOM 进一步加重，这是由于从第二个治疗周就逐渐开始抵消剂量，故在分割照射结束后可依据实验需要进行类似于单剂量照射的额外补充照射［7］。Talwar 等［13］以8 周龄的C57Black/6 雌性小鼠为实验对象，使用特制的树脂夹具在不麻醉小鼠的情况下固定动物，137铯作为放射源，以剂量率2.35 Gy/min，8 Gy/d，持续5 d 对小鼠头颈部进行照射来诱发RTOM。Kim 等［16］使用雄性Sprague-Dawley 大鼠作为研究对象，使用特制固定装置促进大鼠头部和颈部上方均匀的辐射分布，剂量率为2 Gy/min，总剂量18 Gy照射颈部区域。

1.2.2 X 射线照射联合化疗药物诱导法 部分研究者在采用X 射线照射时辅助使用化疗药物来诱导模型，也取得了不错的效果。Wu 等［18］使用雄性LVG 金仓鼠为研究对象，在0～3 d，6～9 d 以6.5 Gy/d，总共给予52 Gy 的辐射剂量，并于第0 天和第6 天放射前2 h 腹腔注射两次5 mg/kg 的顺铂，以此成功复制模型。Zhao 等［15］使用雄性BDF-1 小鼠作为实验对象，先连续2 d 腹腔注射50 mg/kg 的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），然后进行相对低剂量的全身照射（10 Gy）。此外，该小组还设计了一个具有严重口腔黏膜炎临床特征，即舌头溃疡的动物模型，以特制夹具固定小鼠并限制辐射区域为小鼠头颈部，照射方式选择单剂量照射，剂量为30 Gy。这种方法死亡率低（＜10%），并可见明显的舌头溃疡，溃疡在第9 天左右发展到峰值。

多年来通过对RTOM 动物模型的研究和完善，人们对于RTOM 有了一定的认识，如各种照射条件下的ED50（诱发50%实验对象出现溃疡体征的期望照射剂量），小鼠单剂量照射的ED50为（11.9 ± 1.0）Gy，分隔照射的1 周和2 周的ED50分别为（6.9 ±3.2）Gy 和（8.3 ± 2.1）Gy［7］。单剂量照射中溃疡发生率、大小等具有显著的剂量依赖性，18 Gy 照射时小鼠有100%存活率，但超过18 Gy 时小鼠的存活时间会因为无法纠正的体重减轻和脱水而无法超过10 d［11］。啮齿类动物对放射线的耐受程度显著高于人类，这主要与上皮细胞内的增殖重组有关，对小鼠进行分隔照射第二周开始，随着治疗时间延长小鼠对放射线的耐受性增加。单剂量照射时照射剂量的选择与所期望诱导的RTOM 严重程度有关，与临床治疗头颈肿瘤无关，因为临床给予患者的剂量受到正常组织反应的限制，所以分隔照射的建模方式更加贴近临床，但是对于小鼠来说，分隔照射所需要的多次麻醉有可能导致小鼠的死亡率升高。除此之外，RTOM 模型还受到结构体积等的限制，如与人类口腔结构不同，照射过程影响其他重要器官，如放射性脑病等并发症影响实验进展。

2 CTOM 动物模型复制方法

2.1 实验动物

不同种类的实验动物模型优缺点与RTOM 动物模型类似，目前文献报道研究者在复制CTOM 动物模型时多采用4～7 周的金仓鼠［19-26］，也有研究者采用6～10 周的小鼠ICR［27］、BALB/c［28］、BDF-1［15］等复制模型，少数研究者则选择了Wistar 大鼠［29-30］、白化兔［31］等作为实验对象。

2.2 实验方法

2.2.1 单纯化疗药物诱导法 5-FU 是一种抗癌药物，通过特异性影响细胞周期S 期来发挥作用，5-FU 比其他非特异性影响细胞周期的药物具有更强的毒性，毒性包括口腔黏膜炎或溃疡，骨髓抑制等［32］，所以部分小组选择仅以5-FU 来诱导口腔黏膜炎。Chang 等［28］采用6～8 周龄的雄性BALB/c 小鼠，在实验的第1、8、15、22、29 天依次以100 mg/kg的剂量对小鼠腹腔注射5-FU，然后在实验的第3、17、31、45 天将小鼠处死进行组织学检查。Zhao等［15］则通过向小鼠腹腔注射50 mg/kg 剂量的5-FU或者250 mg/kg 的CPT-11 来诱导CTOM。CTOM 动物模型构建的目标是成本更低，比传统模型更安全、更快速，以及产生明显的溃疡，以更好地估计药物的效果。仅对实验动物腹腔注射5-FU，因小鼠口腔较小和缺乏颊囊而未行机械损伤诱导的小鼠模型在宏观观察时未观察到出血、广泛溃疡和脓肿，主要以红斑为主［28］，故基于5-FU 的CTOM 动物模型还应联合其他刺激。

2.2.2 化疗药物联合机械损伤诱导法 部分研究者在复制CTOM 动物模型时选择了一种注射5-FU联合机械损伤的模式，机械损伤的目的是加强口腔黏膜炎和重现临床症状［33-34］。Barbosa 等［19］使用150～200 g 的雄性金仓鼠作为实验对象，在实验的第1，2 天分别以60 mg/kg 和40 mg/kg 的剂量向仓鼠腹腔注射5-FU，第4 天在麻醉条件下用18 mm 针头的尖端对仓鼠右侧的颊囊进行机械损伤。临床和组织学评估均提示该模式诱导的黏膜炎与人类口腔黏膜炎类似，并遵循骨髓抑制程度的影响。

2.2.3 化疗药物联合其他方式 以化疗药物联合其他刺激如乙酸注射、红外照射等也是部分研究小组在复制CTOM 动物模型时采用的复制方法，均取得的不错的效果。Molina 等［24］采用8 周龄的雄性金仓鼠作为实验对象，在第0 天和第2 天以60 mg/kg 的剂量注射5-FU，第2 天和第3 天向右侧颊黏膜注射30 μL 乙酸（10%），以5-FU 联合乙酸的方法成功诱导了CTOM。Yoshino 等［23］报道了在仓鼠颊囊中用5-FU+乙酸处理比两种药物单独处理可诱导更大的口腔黏膜炎区域，而且在实验期间与盐水对照组相比仓鼠的重量几乎没有差异。5-FU联合乙酸诱导的口腔黏膜炎动物模型简单，便宜且广泛适用，无需机械损伤也可产生明显的溃疡。Reda 等［31］则采用了1.7～2 kg 的白化兔作为实验对象，兔子禁食2 h后在麻醉下肌肉注射35 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg 甲苯噻嗪。为了诱导黏膜溃疡，50%乙酸浸泡的棉球按压在兔口腔两侧颊黏膜组织60 s。Patel 等［29］通过使用化疗剂和红外辐射的组合在大鼠中成功诱导了口腔黏膜炎，小组选取了雌性14～16周龄，150～200 g的Wistar大鼠作为实验对象，以白消安作为化疗剂，6 mg/kg的剂量口服给药4 d，大鼠舌头于第1、4、10 天暴露在40 mV/cm2的红外下辐射5 s。

3 动物模型效果评估

3.1 大体样本观察法

大多数研究小组在进行大体样本观察时选择直接观察法，这种方法简单方便，无需染色。部分研究组采用评分标准进行评估，即观察出现红斑、糜烂、血管扩张、上皮溃疡和脓肿等主要体征。一般多采用如下的评分标准：0 分为正常黏膜，无糜烂和血管扩张；1 分为红斑，黏膜无糜烂；2 分为严重红斑，血管扩张和表面糜烂；3 分为一处或多处溃疡形成，溃疡总面积＜25%，严重红斑和血管扩张；4 分为颊囊表面溃疡累积约50%；5 分为颊囊黏膜几乎完全溃疡，黏膜柔韧性丧失［21］。也有小组采用Parkins 等［5］之前开发的评分系统，即0 分为正常，0.5 分为轻度粉色，1 分为轻度红色，2 分为重度红色，3 分为局部剥脱，4 分为渗出覆盖不到黏膜的50%，5 分为黏膜几乎完全溃疡［29］。Shimamura等［27］通过测量溃疡的面积和自发恢复的时间来评估CTOM 模型。

3.2 甲苯胺蓝染色法

部分研究小组为了更精确地确定溃疡的范围，采用甲苯胺蓝染色法以使溃疡可视化，切除实验动物的舌头用0.05%甲苯胺蓝染色10 min，然后用10%乙酸漂洗1 min，成功染色后可见溃疡为深蓝色。通过测定染色区域和整个舌面区域的百分比可测量黏膜炎和溃疡面积［10］。

3.3 组织病理学观察法

在组织病理学上的评估也多采用评分的方式，将样品固定在10%中性缓冲福尔马林中，脱水并包埋在石蜡中，切片（5 μm）HE 染色后于光学显微镜（×40）观察。以单盲方式确定炎性细胞浸润，血管扩张，出血区域，水肿，溃疡以及脓肿的存在。评分标准如下：0 分为正常上皮和结缔组织；1分为不连续区域的血管扩张或再上皮化，轻度炎症浸润；2 分为中度血管扩张，上皮组织变性，中性粒细胞炎症浸润，出现出血区域、水肿及溃疡，但无脓肿；3 分为严重血管扩张和中性粒细胞炎症浸润［19］。

4 小 结

一个好的口腔黏膜炎动物模型应该是与人类口腔黏膜炎具有相似性，形成率高，死亡率低，重复性好，病变易观察，建模方法简便易行。本文中各种动物模型复制方法均能成功复制口腔黏膜炎动物模型且基本上满足上述条件，但是由于实验动物本身体积过小，口腔黏膜组织与人类差异明显等问题，放化疗性口腔黏膜炎动物模型需要有进一步的更新和改进。随着新技术、新方法的提出，放化疗性口腔黏膜炎动物模型会成为研究口腔黏膜炎发病机制及防治手段的重要工具。