食品中致敏蛋白的检测技术研究进展

王世鹏

（黑龙江省标检产品检测有限公司，黑龙江哈尔滨 150000）

食物过敏也称为消化系统变态反应或食物变态反应等，是指利用所摄入食物的某种组成成分作为抗原，将其与机体中相应抗体发生免疫应答而产生的一种变态反应疾病。如今，食物过敏已成为全球公共卫生问题，是全球第六大疾病。据统计，全球食物过敏案例明显增加，英国有7%儿童食物过敏，澳大利亚有9%，而我国儿童食物过敏患病率高达6.2%，这比一般疾病的患病率要高很多。而在世界变态反应组织报告中显示，过敏现象困扰了全世界30%～40%的人口。此外，相关研究表明食物过敏能够对不同的人群产生相应的负面影响，并且与焦虑症的增加有紧密关系[1]，因此食物过敏严重影响人们的日常生活和身体健康。

为降低食物过敏的风险，保障消费者的安全，欧盟、美国、加拿大、日本等多个国家已经发布了相关条例，要求在食品标签中标明食物的致敏原和含量[2]，我国发布GB 7718—2011《预包装食品标签通则》、GB/T 237792—2009《预包装食品中的致敏原成分》等法规中也明确规定要在相应的包装标签上注明致敏物[3]，为消费者提供一定的食用安全保障，即使能在一定程度上降低食物中毒的几率，但依然存在很大的风险。此外，据调查结果表明食物中的主要致敏物质是蛋白质。因此，针对食物中的致敏蛋白能够进行准确、有效的检测可以减少食物过敏现象，对于消费者的健康提供了有效保护。对当前食品中致敏蛋白的快速检测技术进行调研也变得非常有意义。

1 食品中致敏蛋白概述

食品中主要的致敏原是蛋白质，一般为相对分子质量10～70 kD的蛋白质或糖蛋白。根据引起的过敏反应的临床特点和速度不同，可以将过敏反应分为4类：I型过敏反应，即速发型过敏反应；II型过敏反应，又称细胞毒性型过敏反应；III型过敏反应，即免疫复合物型过敏反应；IV型过敏反应，也就是迟发型过敏反应。根据抗体种类的不同又可将介导分为2种类型：由抗体蛋白IgE介导型、由非抗体蛋白IgE介导型。其中，最常见的食物致敏反应属于IgE介导型[4]。IgE介导型的过敏机理是指过敏抗原通过机体的诱导进入体内，促进体内IgE的生成，继而IgE结合到肥大细胞和嗜碱性粒细胞，使机体进入对该过敏原特异致敏状态，当过敏原再次接触时，与细胞膜上的IgE受体结合引起一系列生化反应，继而释放出诸如组织胺等各种与过敏反应和炎症有关的生物活性介质。由此可见，特异性IgE对于致敏蛋白的致敏作用有着很大的影响，两者的结合是导致致敏蛋白发挥致敏性的主要环节。因此，通过检测特异性的IgE表达量，能够反映出致敏抗原的情况，从而对检测致敏蛋白有着重要的指导意义。

2 食品中致敏蛋白的检测技术进展

由于食物致敏作用对于人的健康有着严重的威胁，因此食品中致敏蛋白的检测技术有着重要的研究价值和意义。当前用于检测致敏蛋白的技术根据检测部位的不同分为体内检测和体外检测2种。体内检测是利用动物模型、人体皮肤或者双盲安慰剂对照食物激发试验进行定量或半定量地对食物致敏原的过敏活性进行检测，但具有一定的风险率，因此限制了检测方法的应用范围[5]。体外检测技术主要分为直接检测致敏蛋白质的方法和针对蛋白质中基因检测方法。基于致敏蛋白的检测方法主要有酶联免疫吸附法、电泳法、高效液相色谱与质谱分析法等。

2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是现在检测致敏蛋白普遍使用的一种方法，其原理通过一种用酶标记的抗体和相应的致敏蛋白进行免疫反应，利用蛋白酶作为指示剂，使蛋白酶作用后底物的显色深浅来反应被测食品中抗原或抗体的含量，一般多采用双抗体夹心法，即选用固相载体上的抗体将和相应的致敏蛋白结合，形成抗原抗体复合物，然后将带有酶标记的另一种抗体和抗原抗体复合物相结合，使之发生显色反应，颜色越深抗原吸附在固相载体的量越多[5]。双抗体夹心ELISA法能够提高测定的灵敏度、准确性和检测速度，此外还有间接法、竞争法等。李晓燕等人[6]通过建立双抗体ELISA法测定虾中的致敏蛋白，得到了虾中致敏蛋白的检出最低限为40 ng/mL，在40～1 000 ng/mL的范围内线性良好。

2.2 电泳法

电泳法是指利用待测溶液中被测蛋白的质量和所带电荷的不同，在外加电场的作用下能够在惰性介质中形成狭窄的区带，所形成的区带在紫外光下能够准确测定分子量、等电点、纯度等参数，从而能够得到所测致敏蛋白的含量。电泳法主要有经典电泳法、免疫亲和毛细管电泳法、区带毛细管电泳法以及凝胶毛细管电泳法等。经典电泳法效率低、耗时长、且商业化的试剂盒不够成熟，因此经典电泳法并不广泛用于致敏蛋白的测定。田兰等人[7]利用聚乙烯醇涂层毛细管，在紫外检测214 nm，分离电压20 kV条件下对乳及乳制品中的α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg） 等5种蛋白进行分离测定。结果显示，蛋白线性良好，测定的鲜奶中α-乳白蛋白（α-La） 含量为0.93 mg/mL，β-乳球蛋白 （β-Lg） 含量 2.67 mg/mL，α-酪蛋白 （α-CN） 14.32 mg/mL，β-酪蛋白 （β-CN） 4.12 mg/mL而k-酪蛋白（k-CN） 9.36 mg/mL。5种蛋白线性良好，线性相关系数均大于0.997 8。

2.3 高效液相色谱与质谱分析法

高效液相色谱与质谱分析法（LC-MS/MS） 是将色谱的分离能力和质谱的定性能力结合起来，能够全面有效地对多种致敏蛋白进行定量和定性分析，并且操作简便易行。洪宇伟等人[8]通过建立LCMS/MS定量检测方法来测定烘培食品中花生过敏原Ara h2的含量，结果表明花生样品中致敏蛋白Ara h2的定量限达4.45 μg/g，可回收率在106.0%～107.8%。李丽芳等人[9]在原有LC-MS/MS的基础上进行了改进，利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLCMS/MS）检测大豆中主要的致敏蛋白，最终成功筛选到可用于表征11种大豆主要过敏原（大豆球蛋白的G1、G2、G3、G4和G5亚基，β-伴大豆球蛋白的α"、α和β亚基，P34，P28及KTI）的特征肽段共29条，相较于原有的LC-MS/MS检测分析法的，UPLC-MS/MS检测目标更广泛，检测结果能更全面、准确的显示出致敏蛋白的种类。

2.4 实时荧光聚合酶链式反应法

实时性聚合酶链反应是基于基因水平上对致敏蛋白进行检测的一种方式，即定量测定样品中特定DNA序列的聚合酶链反应。利用荧光实时聚合酶链式反应方法检测食品中Ara h1基因成分，从而推断食品中是否含有花生过敏主要过敏原成分。结果显示，标准曲线在3×102～3×108copies的范围内线性良好，检测低限设定为3×103copies。目前实时荧光聚合酶链式反应测定技术可以对食品中的致敏蛋白进行定量定性检测，能够针对特定食品中致敏蛋白的DNA进行检测，灵敏度高，准确性好。

3 结语

随着社会经济的发展和国际食品安全水平的提高，引起人们对于食物致敏等问题的高度重视，对于食品的安全性也有了更高的警惕性，因此保障食品安全，保证消费者的食用健康是当前研究的热点课题。建立食品中致敏蛋白的检测技术，能够较大程度的减少食物过敏情况的发生，具有重要的研究价值和意义。介绍了几种主要的食品中致敏蛋白的检测方法，但各类方法都存在相应的限制性和缺陷，因此需要对当前的检测技术进一步优化和改善，从而提高食品的安全性。如今基因水平的检测方法是食品检测领域中的一个重要发展方向，能够定量定性地检测食品中的致敏蛋白成分。因此，将一些新型标记材料运用于基因水平的检测技术，能够提高检测的效率和准确性，对于食品中致敏蛋白的检测具有深远意义。