猪血凝性脑脊髓炎实验室诊断方法综述

张文通，李金祥，魏 凤，李 峰，沈志强，

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.河北孟村回族自治县农业农村局，河北 孟村 061400；3.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600）

猪血凝性脑脊髓炎（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis,PHE）是由冠状病毒属的血凝性脑脊髓炎病毒（Hemagglutinatingenc ephalomyelitis virus, HEV）引起的一种急性、接触性传染病[1-2]。主要感染幼猪，以呕吐、食欲废绝、便秘、进行性消瘦、腹泻及中枢神经系统功能障碍为特征，临床上也称之为仔猪呕吐-消瘦病，病死率高达20%～100%。1958年该病在加拿大的安大略省首次暴发，此后在世界各主要养猪国家都相继发生。我国于1985年在北京郊区某种猪场首次报道发生HEV感染。赵传博等应用血凝抑制试验（HI）检测辽宁省部分地区猪血清中HEV抗体阳性率高达44.0%[3]；刘立卓等应用HI方法对从山东省部分地区采集的178份猪血清样品进行了HEV抗体检测，HI抗体总体阳性率高达61.24%[4]。由此可见该病在养猪场感染很普遍，对养猪业威胁严重，但很多养猪场乃至基层从事养猪科研工作者对该病都很陌生。因此对该病相关实验室检测研究进展进行综述，很有必要。

防治该病的关键措施之一是对该病病原的确诊。该病在症状上与猪伪狂犬病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等相类似，仅凭流行病学调查、临床及剖检诊断无法鉴别，确诊必须依靠实验室诊断。自20 世纪50 年代末期首先发现该病以来，科研工作者对该病实验室诊断方法进行了大量的研究，取得了显著成绩。文章就该病实验室诊断方法研究进展进行了如下综述。

1 病毒分离鉴定

首先采集疑似HEV 感染病猪的脑、脊髓、呼吸道分泌物等组织；将病料组织研磨，反复冻融，过滤除菌处理；接种于长满单层的易感细胞如猪肾原代细胞单层或甲状腺单层细胞中进行培养72 h，观察有无融合细胞出现。如果有HEV 存在，即可在接种后24 h 至48 h 出现融合细胞。最后将分离后的细胞病毒液收集后，反复冻融，透射电镜观察病毒粒子形态应呈典型的 冠状病毒”。

2 血清学诊断

2.1 血清中和试验

首先将待检血清56 ℃ 30 min进行灭活；将PHEV 病毒液与不同稀释浓度的待测血清按照1:9 均匀混合，37 ℃温箱孵育1 h；将每个滴度混合后的悬液加入到长满单层的胎猪肾细胞的试管中；培养72 h后，检测培养液的鸡红细胞的凝集活性。以此来检测病毒是否在细胞上增殖。通常把中和抗体的效价1:8或更高，可判为阳性，否则判为阴性。

2.2 血凝抑制试验

血凝抑制试验主要用于检测待检血清对红细胞凝集的抑制情况。在此试验中，通常要设定已知的阴性血清、阳性血清、红细胞、抗原以及不加抗原的待检血清作为对照，同时，要在保证各对照孔没有错误的情况下，对结果进行评价和分析；最后以结果中出现完全抑制的血清稀释倍数为HI 效价。应用本法检查被检血清的红细胞凝集抑制价在1:40 以上判为阳性。周铁忠等用HI 检测辽宁各地区HEV 感染情况，结果显示阳性率为49.6%[5]。贺文琦等应用HI 检测了从吉林省部分地区采集的猪血清中HEV 抗体，阳性率高达44.3%[6]。HI 方法的建立，对PHEV 的诊断和防治是一种非常实用的技术手段。

2.3 琼脂扩散试验

首先制作琼脂糖平皿，然后分别在中间和周围打孔（中央孔与周围孔的间距一般以3 mm 为宜）。在中间的孔中加入抗原，待检血清、阴性和阳性血清分别加入到周围孔中；将琼脂糖平板放置湿盒内，然后将湿盒置于37 ℃条件下培养24～48 h，观察特异性沉淀线。如果抗原与待测血清产生的沉淀曲线与抗原与阳性对照的血清作用产生的沉淀线相融合，则可判断该待测血清为阳性，不出现线则为阴性。该方法操作简单，可以用于PHEV 血清抗体的流行病学调查。

2.4 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附试验（ELISA）原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定性或定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。其方法简单，方便讯速，特异性强，敏感度高，已在多个领域得到广泛应用。

赵传博等用HEV 的单克隆抗体作为检测抗体、HEV 的多抗作为捕获抗体，建立了检测HEV 的抗原捕获ELISA 方法，抗原捕获ELISA 阳性检出结果与PCR 方法相一致[7]。单长见等以HEV 纯化的N 重组蛋白作为包被抗原，建立检测HEV 血清抗体的间接ELISA 方法，用该法对天津市地区采集到的200 份猪血清样品进行检测，阳性检出率为83.5%[8]；刘立卓等以纯化HEV 为包被原建立检测HEV 血清抗体的间接ELISA 方法，应用该ELISA 方法对从山东地区猪血清中随机抽取的44 份样品检测HEV 抗体阳性率为72.73%[4]。

3 分子生物学检测技术

目前运用于检测HEV 的分子生物学检测技术主要是RT-PCR 技术和荧光定量PCR 检测技术。

RT-PCR 即逆转录PCR，是将RNA 的逆转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增反应相结合的技术。RT-PCR 技术优点是灵敏，缺点是易被污染。该方法已经得到了比较广泛的应用。常灵竹等根据GenBank中登录HEV 的HE 基因和S 基因设计了1 对引物，建立快速检测HEV的RT-PCR 方法，检测与HEV 亲缘性较高的牛冠状病毒及猪的伪狂犬病毒均为阴性，最低可以检测到10个TCID50/100 μL 的病毒，说明该方法的有较好的特异性和敏感性[9]。

荧 光 定 量PCR 是1996 年 由美国Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR 产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。臧德跃等根据GenBank 中的HEV 的S 蛋白基因保守序列设计合成1 对特异性引物，建立了检测HEV 的SYBRGreen Ⅰreal-time PCR 方 法；应用该方法对采集的20 份疑似HEV感染病料进行检测，其中16 份为阳性，而用常规PCR 检测同样的样品，仅8 份为阳性，由此可见该方法较常规PCR 方法敏感得多[10]。

HEV 主要侵害1 ～3 周龄乳猪，被感染仔猪发病率和死亡率都达100%。成猪一般为隐性感染，但可排毒。对发病仔猪进行HEV 诊断及对成猪隐性带毒HEV 筛查均依靠HEV 实验室诊断。文章对HEV实验室诊断方法研究进展进行了综述，对开展HEV 综合防控研究提供了详实的资料。