猪鼻支原体分子生物学检测方法研究进展

李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis,Mhr）无细胞壁，大小介于细菌和病毒之间，具有高度可变的多种形态，可在细胞内寄生，也能在体外培养基纯培养，但初次分离难度大。Mhr是细胞培养过程中常见污染源，也与人类肺癌、胃癌、乳腺癌、大肠癌等多种癌症具有相关性，Mhr具有重要的公共卫生学意义。Mhr对外界环境抵抗力弱，常规消毒剂即可迅速杀灭。Mhr感染猪后能引起猪肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、结膜炎、中耳炎等多种疾病[1]，3～10周龄仔猪多发[2]，一年四季均可发病，可造成猪生长发育缓慢，饲料报酬降低等，常与其它猪病混合感染，加重病情[3]。Mhr主要通过直接接触和呼吸道飞沫传播。Mhr是猪鼻腔、气管、支气管黏液中的常在菌，10%母猪和40%断奶仔猪呼吸道黏液中均有该菌存在[4]，当猪群密度大、通风不良、饲料突变、转群、断奶或受到其它应激时容易发病。Mhr作为一种条件性致病菌，长期被忽视，近年来，Mhr引起的疾病增加，对猪场危害严重。本文就近年来Mhr常规PCR法、套式PCR法、多重PCR、荧光PCR方法、环介导等温扩增技术等5种分子生物学检测方法研究进展进行综述，以期为该病的快速诊断和防控提供参考。

1 常规PCR法

PCR是以病原核酸为模板进行病原快速检测的方法，较病原分离鉴定等传统的方法，检测速度快、灵敏度高，在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。沈强等[5]建立一种可靠的Mhr PCR检测方法，扩增Mhr目的基因大小为364 bp，最低可检测模板浓度0.5 ng/mL的Mhr DNA含量，方法特异性好，与其它猪常见导致呼吸道和多发性浆膜炎病原无交叉反应。李石友等[6]采集疑似Mhr的感染病猪肺脏并提取DNA作为模版，根据GenBank的数据库中Mhr膜蛋白P37的序列设计1对特异性引物，建立Mhr PCR检测方法。试验结果显示，扩增目的基因片段大小为494 bp，该法最低可检测浓度为3.44×10-8ng/μL Mhr DNA含量，为快速准确鉴别Mhr提供了一种有效的临诊手段，也对药物的使用具有指导意义。

2 套式PCR法

套式PCR，又称巢式PCR。采用两对引物扩增目的基因片段，第2对引物在第1对引物的内部设计，以第1对引物的扩增产物为模板进行再次扩增，经两轮扩增，保证了扩增产物的特异性，提高了PCR检测的敏感性。白方方等[7]应用巢式聚合酶链式反应建立了一种检测Mhr的方法，试验中以酚-氯仿法制备模板DNA，根据Mhr P37序列高度保守区设计2对引物，建立Nested PCR诊断方法。在特异性检测试验中，设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒2型及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体。敏感性试验表明，第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01 mg/L和3.01×10-4mg/L。对41份临床样品肺组织的检测中，普通PCR和巢式PCR的检出率分别为 29.3%（12/41）和 82.9%（34/41）。彭凌等[8]根据Mhr P69基因序列设计2对引物，建立了Mhr套式PCR诊断方法，对建立的方法进行特异性、敏感性检测，同时进行临床检测。结果表明，应用建立的套式PCR方法对MhrDNA的检出限为1.4×10-5ng/μL，与常见感染猪的细菌、病毒均无交叉反应。利用建立的套式PCR方法对23份临床样品进行检测，阳性检出率为73.9%。

3 多重PCR法

多重PCR是一种特殊的PCR技术，它在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或2种以上的病毒DNA，它具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点而广泛用于临床的快速诊断。吴静波等[9]根据副猪嗜血杆菌（HPS）的P2蛋白基因和Mhr的P37蛋白基因分别设计了1对引物，建立HPS和Mhr双重PCR检测方法，并进行特异性和灵敏度试验，同时应用所建立方法对临床样品进行检测。结果显示，该方法可特异性检测出HPS和Mhr，对其他细菌无非特异性扩增，检测灵敏度可达到100 copies，并可根据扩增产物的大小区分HPS P2蛋白基因的Ⅰ和Ⅱ两个基因型，初步判定HPS的致病性。对32份呼吸道疾病临床样品的检测结果显示，HPS和Mhr阳性率分别为59.4%和53.1%，双重感染的样品为34.4%。刘茂军等[10]根据猪肺炎支原体（MHP）和Mhr的16S rRNA基因设计3条引物，建立MHP和Mhr的双重PCR检测方法，并对该方法进行了特异性和敏感性试验。应用建立的方法检测了临床样品和疫苗样品。结果显示，该方法具有良好的特异性，最低可检测到0.66 ng的MHP基因组DNA和0.58 ng Mhr基因组DNA。临床样品和疫苗样品检测结果与普通PCR检测结果一致。

4 荧光PCR方法

荧光PCR是在常规PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，它融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，检测速度快、敏感性高，可直接观察扩增结果，不需要后续电泳检测扩增产物，减少了对环境气溶胶污染的可能，避免了假阳性结果。据信号基团的不同，实时荧光定量PCR可以分为染料法和探针法两种。白方方等[11]根据GenBank中登录的Mhr P37基因序列设计并合成引物及MGB探针，构建含有P37基因的重组质粒，以其为标准品绘制标准曲线，并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良好的特异性，与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应，对Mhr的检测敏感性为10 copies/μL，并且稳定性好，变异系数小于2%。利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测，阳性检出率为87.3%（48/55），而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8%（23/55）和29.1%（16/55）。武昱孜等[12]根据MHP P97序列和Mhr P37序列的特异性引物，分别标记FAM和Texas Red荧光报告基团的2条TaqMan探针，建立和优化双重实时荧光定量PCR反应条件和体系，同时检测其敏感性、特异性和重复性。建立的双重荧光定量PCR对猪肺炎支原体和Mhr的最低检测值均为10 copies/μL，与猪源致病菌、病毒和其他常见细菌均无交叉反应，各浓度标准品的Ct值变异系数小于5%，重复性好。检测72份临床样本，其中猪肺炎支原体的肺阳性率为80%，鼻拭子阳性率为22%，支气管肺泡灌洗液阳性率为58.33%，Mhr的肺阳性率为40%，鼻拭子阳性率为66%，支气管肺泡灌洗液阳性率为41.67%。

5 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（LAMP）方法是日本学者Notomi等发明的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，不需要复杂的仪器设备，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器等优点，特别适合在现场和基层部门应用。刘博婷等[13]以Mhr的P37基因序列为靶基因，设计1组特异性引物，对反应体系的引物浓度、MgSO4、dNTPs、反应温度和时间进行优化，并进行了特异性和灵敏度试验，旨在建立Mhr的简便、快速、准确的分子检测方法。同时应用所建立的方法对临床样品进行检测，结果显示，最佳反应体系为MgSO46 mmol/L，dNTPs 1.2 mmol/L， 内引物（FIP/BIP）1.6 μmol/L，外引物（F3/B3）0.2 μmol/L，Bst DNA 聚合酶8 U，60℃扩增60 min。灵敏度是常规PCR的100倍，并且与其他病原菌无任何交叉反应。对23份呼吸道疾病临床样品进行检测的结果显示，普通PCR和LAMP的检出率分别为23.4%和79.6%。

6 小结

疾病的正确诊断是进行有效防控的前提和基础，随着规模化养殖的发展，临床上的猪病变得越来越复杂，老病新发和疾病混感现象增加，很难通过临床表现和眼观病变诊断疾病，需要通过实验室检测进行精准诊断，从而及时采取有效的措施，降低损失。Mhr是猪只体内的常在菌，当猪受到应激时，容易发病，近年来，引起了广泛关注，可与多种疾病混感后继发多种疾病，给养猪业造成严重的经济损失。传统的病原分离方法操作繁琐，耗时长，对临床疾病的诊断不实用，血清学方法不能判定是否现症感染，只能说明猪只以前曾经感染过Mhr，结合猪群表现出的临床症状和病变表现，进行分子生物学检测，是当前诊断该病最可靠的方法。当前有多种Mhr分子生物学检测方法，但各有利弊，常规PCR方法虽然检测速度快、特异性强，但不能定量，且检测敏感性不高。荧光PCR方法虽然克服了常规PCR的缺陷，但仪器和探针的合成价格昂贵，检测成本比较高，不适合基层应用。LAMP方法虽然简单、方便，适合基层进行推广应用，但灵敏度太高，易出现假阳性结果。随着技术的不断发展，已经出现了免核酸提取荧光PCR扩增技术、便携式荧光PCR仪器及除模板外PCR组份冻干保存技术，如能应用于Mhr分子检测，必将开发出更方便、更快捷、成本更低的病毒分子检测技术，方便疾病快速确诊，从而更好地做好Mhr的防控工作。进行病料检测时一定要选择合适的病料样品，活猪可采集鼻腔式子，具体做法为将棉签伸入猪鼻中隔刺激，猪打3次喷嚏后，拔出棉签，pH 7.4 PBS液中4℃冰箱浸泡过夜，10 000 r/min离心5 min，取沉淀提取基因组DNA。死亡猪可采集病变与健康交界处肺脏组织。针对Mhr无有效疫苗预防，虽可用林可霉素、大环内酯类药物治疗，但容易产生耐药性，效果不理想，只能采取综合性防控措施，如加强饲养管理，提高猪只机体抗病力。饲喂优质全价配合饲料，不喂霉变饲料。猪舍加强保温，保持猪舍清洁卫生，做好消毒工作，定期通风、降低氨气浓度、减少饲养密度、减少应激以降低Mhr相关疾病发病率和病情的严重程度。