死产母猪血清中猪圆环病毒3型的研究

乔国峰，李红丽，王国艳，孟 帆，米瑞娟，张国权，王志宇，孙仰介，薛俊龙，刘 源，薛翼鹏

（山西农业大学动物医学学院，山西太原030032）

圆环病毒属于圆环病毒科，由4种猪圆环病毒（PCV）组成（PCV1、PCV2、PCV3和PCV4）。PCV1于1974年被发现是猪肾（PK-15）细胞系的污染物，是猪的非致病性病毒[1]。20世纪90年代，PCV2被发现并随后与一系列综合征相关，统称为猪圆环病毒病（PCVD）[2]。2016年，在美国发现了PCV3，其临床症状与猪皮炎和肾病综合征（PDNS）相关[3]，并患有心脏和多系统炎症[4]。之后，在亚洲、欧洲和南美洲在内的世界范围内都有报道[5]。PCV3具有一个环状的单链DNA（SsDNA）基因组，长度约为2 000个核苷酸，2个主要的ORF在相反的方向上，编码衣壳（Cap）和复制酶（Rep）蛋白[3-4]。据报道，PCV3与不同的临床/病理条件有关，包括猪皮炎和肾病综合征、生殖障碍、呼吸问题、腹泻以及多系统炎症和心肌炎[5-12]。有研究表明，在有类似PDNS症状的猪和临床无症状猪的血清中均检测到了PCV3，证明该病毒存在致病潜力[13]。山西省农业科学院畜牧兽医研究所预防兽医研究室在母猪的混合血清样本中发现了PCV3基因组，为了搞清母猪血清中PCV3的存在是否与死产的发生有关，采集了分娩后死产母猪与无死产母猪的血清，调查PCV3的感染率和DNA载量，为更深入地研究PCV3与死产发生的联系提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 采集2020年5—8月山西临汾、长治地区6个规模化养猪场中刚生产的母猪血液。样本被分成2组：一组是产时至少有1头死产仔猪的母猪（46头）血清，另一组是没有死产仔猪的母猪（43头）血清。所有母猪在临床上都是健康的。

1.1.2 主要试剂 柱式DNA提取试剂盒购自上海凡济生物科技有限公司；TOPO质粒和2×Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG购自Invitgen公司；BL21感受态细胞购自北京博迈德生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 用柱式DNA提取试剂盒从200μL的血清中提取脱氧核糖核酸。用微量分光光度法验证DNA的质量。

1.2.2 PCV3的实时荧光定量PCR检测 参照GenBank中公布的PCV3全基因序列设计1对引物，并用Primer BLAST软件进行计算机评价，验证引物的特异性。引物正向序列为5′-AACGGTGGG GGGTCATATGTGTTG-3′，反向序列为5′-AGACGA CCCTTATGCGGAAA-3′（基因组位置1441-1616），扩增片段大小为175 bp。通过在TOPO质粒（Invitgen）中克隆扩增子，然后转化感受态大肠杆菌（BL21）所获得的标准曲线来评估qPCR的检测限。提取质粒并定量，并用DNA分子构建1×108～1×100的标准曲线。反应的最终体积为12.5μL，循环条件为：50℃2 min，95℃2 min，扩增40个循环（95℃15 s和60℃30 s）。通过逐渐升高温度（0.3℃）60～95℃绘制熔化曲线，通过与标准曲线的比较来确定病毒DNA的拷贝数。

1.3 统计分析

用卡方检验比较了有死产仔猪和无死产仔猪母猪之间PCV3感染的发生率。用Wilcoxon-Mann-Whitney U检验比较病毒DNA载量。

2 结果与分析

2.1 PCV3感染率分析

经BLAST分析，qPCR具有特异性，定量限为10个拷贝数的PCV3 DNA，效率为99.4%。然而，也检测到了低于10个拷贝数的DNA含量，尽管不能量化。因此，证明阳性样品的标准是任何循环阈值低于39、比熔体温度为83.4℃的样品。阴性对照没有产生扩增产物，所有DNA样品都显示出良好的质量，A260/A280和A260/A230的比值分别高于1.8和2.0。在检测的89个样本中，57个（64%）被发现含有PCV3基因组。有死产母猪阳性率为67.4%（31/46），无死产母猪阳性率为60.5%（26/43），2组间差异无统计学意义（P＝0.45）。所有被检测的养殖场的样本都检测到了病毒基因组（图1）。

所有养殖场的2组均检测到PCV3 DNA，除第3场分娩正常（无死胎）的母猪血清中未检测到PCV3 DNA外，其余均检出PCV3 DNA。

2.2 PCV3 DNA载量分析

在3号养殖场中，所有分娩正常（无死胎）的母猪均未检测到PCV3。在含有PCV3基因组的57份血清中，只有25份具有可量化的基因组载量，即高于10拷贝/mL的基因组，这是qPCR的定量极限。在这25个样本中，14个对应于有死产的母猪，而11个对应于没有死产的母猪（图2）。对比有死胎和无死胎的母猪，每mL血清中检测到的DNA分子的中间值分别为676和851。在比较2组间的PCV3基因组载量时，没有发现有统计学意义的差异（Wilcoxon-Mann-Whitney U；P＝0.92）。

3 讨论

SHANG等[14]研究表明，只有在产死胎的母猪身上发现了PCV3基因组，但PCV3感染和死胎的发生之间没有明确的联系。本研究设计了一种定量PCR来检测PCV3感染率和血清中的病毒DNA载量。该方法具有99.4%的效率，能够在高通量测序（HTS）中检测到先前阴性的样本中的PCV3 DNA。在之前的检测结果中，可能由于PCV3 DNA载量过低的原因，有一定的误差，因此，该检测技术为后期的研究提供了更加灵敏的检测手段。

然而，在与PCV3感染之间的明确关联已经在有生殖障碍的猪中被报道，如流产和死胎猪[4-6]。事实上，在木乃伊胎儿中，报告了很高的混合感染率，包括猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒2（PCV2）和钩端螺旋体（Leptsp.），但没有阐明PCV3在这种情况下的作用。相比之下，其他研究报告了PCV3在健康动物中的感染率，在某些情况下，PCV3的感染率高于患病动物[15-16]。

在本研究中，无论有没有死产母猪的血清中都发现了PCV3基因组。在3号养殖场中，所有10头分娩正常的母猪在它们的血清中都没有PCV3感染，可能是一个例外，因为其他农场在2组中都有PCV3感染的母猪。本研究结果显示，有或无死胎母猪血清中PCV3 DNA载量无显著差异，提示PCV3可能与母猪死产的发生无关。但值得注意的是，被检查的血清是从刚刚分娩的母猪身上采集的，PCV3感染可能发生在怀孕早期或更早的时期，在妊娠的前几个阶段感染一些其他感染源，也会导致死产。对PCV3感染在整个孕期以及在新近出生和死产的仔猪中的作用应进一步研究，可能会提供有关该病毒导致死产的更多数据支持。

4 结论

通过对母猪血清中PCV3基因组的鉴定，本研究提供了刚产下的母猪感染PCV3的证据。死产的发生似乎与PCV3感染率或分娩时母猪的PCV3基因组载量无关。