潮州地区原发性高血压患者抗高血压药物相关基因多态性分析*

林 芬,吴泳浩，许嘉欣,张 琳，杨立业

南方医科大学附属潮州中心医院中心实验室，广东潮州 521021

原发性高血压(EH)是我国最常见的慢性疾病之一，是导致冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的重要危险因子。根据世界卫生组织报道，在中国18岁及以上成年人中，EH发生率为19.8%[1]，通过药物控制血压并减少EH所致并发症是主要的治疗目标。临床实践表明，不同个体在接受同一种药物治疗时，治疗效果及其对药物的耐受性等方面存在着明显差异，这种差异也表现在药物的代谢、转运等不同阶段，遗传多态性是造成人与人之间药物反应个体差异的本质原因[2]。三类抗高血压药物(β1受体阻断剂、血管紧张素Ⅱ受体抑制剂、血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂)相关基因[细胞色素P450家族成员2C9(CYP2C9)、β1-肾上腺素能受体(ADRB1)、血管紧张素Ⅱ受体1(AGTR1)、细胞色素P450家族成员2D6(CYP2D6)和ACE]的多态性位点CYP2C9：c.1075A>C、ADRB1：c.1165G>C、AGTR1：c.1166A>C、CYP2D6：c.100C>T和ACE：I/D与治疗EH常用药物的疗效紧密相关[2]。潮州地区的饮食、起居、文化和生活习惯自成一体。据调查，潮州地区18岁以上居民的EH发生率为18.29%[3]，以潮州地区EH患者为研究对象，了解上述5个基因位点在人群中的分布情况，为抗高血压药物在本地区不同基因型人群中的合理使用提供理论和实验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2013年3月至2018年4月在该院就诊的325例EH患者，年龄36～89岁，其中男性196例，平均年龄(61.19±12.07)岁，女性129例，平均年龄(61.51±11.21)岁。根据2018年《中国高血压防治指南》中规定的诊断标准[4]，EH为连续3次非同日坐位测量收缩压≥140 mm Hg(18.7 Kpa)或舒张压≥90 mm Hg(12.0 Kpa)。所有研究对象间均无血缘关系，EH患者入选标准为高血压3级，无心、脑、肾、肺或其他任何主要人体器官实质性改变。排除标准为已知的慢性肾脏疾病、1型或2型糖尿病、脑血管病史、冠状动脉粥样硬化性心脏病、妊娠和已知精神病史。

1.2仪器与试剂 DYY-6C型双稳定时电泳仪购自北京六一生物科技有限公司，Tanon 1600全自动数据凝胶成像系统购自上海天能科技有限公司，NanoDrop One核酸蛋白浓度测定仪购自美国热电Thermo赛默飞世尔公司，Life Express 96孔PCR仪基因扩增仪购自杭州博日公司，ABI Prism 3730XL DNA测序仪购自美国ABI公司。外周血基因组DNA提取试剂盒为深圳亚能生物技术有限公司生产，用于PCR扩增的2×Taq PCR Master Mix为北京艾德莱生物科技有限公司产品。

1.3方法

1.3.1基因组 DNA 提取 采集患者乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血5 mL，按试剂盒的操作步骤提取基因组DNA，于-20 ℃保存。

1.3.2引物设计及扩增 针对CYP2C9：c.1075A>C、ADRB1：c.1165G>C、AGTR1：c.1166A>C、CYP2D6：c.100C>T和ACE：I/D基因多态性位点，使用Prime3软件设计5对引物用于扩增，详细序列见表1，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系为2×Master Mix 12.5 μL、正反向引物各1 μL、基因组DNA 2 μL，用灭菌双蒸水补至25 μL。5对引物反应条件如下：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸50 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。

表1 5个基因多态性位点的引物序列

1.3.3基因多态性位点的检测 ACE：I/D基因扩增产物用2%琼脂糖凝胶，100 V下电泳30 min，在Tanon 1600全自动数据凝胶成像系统下鉴定基因型。以100 bp DNA 标志物 I为参照，PCR产物扩增出490 bp的DNA片段为I型，扩增出190 bp的DNA片段为D型，构成3种基因型，仅有490 bp条带者为插入型纯合子(II型)，仅有190 bp条带者为缺失型纯合子(DD型)，同时出现190 bp和490 bp两条带者为杂合子(ID型)。

CYP2C9：c.1075A>C、ADRB1：c.1165G>C、AGTR1：c.1166A>C和CYP2D6：c.100C>T基因位点的PCR扩增产物送上海英骏生物技术有限公司直接测序，结果通过网站http://www.ncbi.nlm.nib.gov/BLAST进行序列比较。

1.4统计学处理 采用SPSS16.0 统计软件进行数据分析，各个基因多态性位点在潮州地区EH人群的分布频率及男、女性患者等位基因频率分布差异均采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.14个基因多态性位点的基因型频率和等位基因频率分布情况 325例EH患者CYP2C9：c.1075A>C等位基因频率为A 96.3%、C 3.7%；AGTR1：c.1166A>C等位基因频率为A 94.2%、C 5.8%；CYP2C9：c.1075A>C和AGTR1：c.1166A>C两位点均以野生型纯合子常见，分别占92.9%和88.3%。ADRB1：c.1165G>C以突变型纯合子最为多见(55.4%)，其次为突变型杂合子(36.9%)，野生型纯合子仅占7.7%，其等位基因频率为G 73.8%、C 26.2%。CYP2D6：c.100C>T突变型杂合子占78.2%，野生型纯合子占21.8%，等位基因频率为C 60.9%、T 39.1%。AGTR1：c.1166A>C和CYP2D6：c.100C>T两位点在潮州地区EH患者中均未检出突变型纯合子。各位点基因型频率和等位基因频率分布情况见表2。

2.2ACE：I/D 基因型频率和等位基因频率分布情况 325例EH患者ACE：I/D基因位点分布为II型160例(49.2%)、ID型136例(41.8%)、DD型29例(9.0%)，等位基因频率为I 70.2%、D 29.8%。EH患者ACE：I/D基因型频率比较，II型>ID型>DD型。基因型频率和等位基因频率分布情况见表2，PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

表2 325例EH患者5个基因多态性位点的基因型频率和等位基因频率分布[n(%)]

注：1为DNA标记物；2、7、10、11、13、14、16、17为II型；3、4、6、8、9、12、15为ID型；5为DD型。

2.3男、女性EH患者5个基因多态性位点的基因型频率和等位基因频率分布 196例男性和129例女性EH患者CYP2C9：c.1075A>C、ADRB1：c.1165G>C、AGTR1：c.1166A>C、CYP2D6：c.100C>T和ACE：I/D基因多态性位点的等位基因频率进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、4。

表3 男性EH患者5个基因多态性位点的基因型频率和等位基因频率分布[n(%)]

表4 女性EH患者5个基因多态性位点的基因型频率和等位基因频率分布[n(%)]

3 讨 论

药物基因组学是一个快速发展的领域，它在遗传基础上阐明个体间对药物反应的差异。本研究调查了与EH药物治疗效果密切相关的5个常见基因多态性位点CYP2C9：c.1075A>C、ADRB1：c.1165G>C、AGTR1：c.1166A>C、CYP2D6：c.100C>T和ACE：I/D多态性位点在潮州地区EH患者中的分布情况，为指导EH患者的合理、安全用药提供参考依据。

CYP2C9 和 CYP2D6 是人细胞色素氧化酶P450家族中2个重要的成员，在我国人群中CYP2C9和CYP2D6基因分别以c.1075A>C和c.100C>T为主要突变类型[2]。CYP2C9占肝微粒体P450总量的20%，能够催化约12%的临床常用药物，CYP2C9通过影响环氧花生酸的合成代谢从而影响血压和血管内皮的功能[5]。与野生型纯合子比较，携带CYP2C9：c.1075A>C的C等位基因的个体对沙坦类药物代谢率显著降低，对于携带 C等位基因的个体服用氯沙坦、厄贝沙坦等药物需适当增加用药剂量以增强降压疗效[6]。本研究结果显示，潮州地区EH人群CYP2C9：c.1075A>C的突变频率为3.7%，接近于李锐等[7]对广东地区EH人群的调查结果。

另一个P450家族基因多态性位点CYP2D6虽仅占肝脏中肝微粒体P450总量的l%～2%，但其对药物代谢有不可忽视的影响[8]。潮州地区EH患者CYP2D6：c.100C>T位点出现最多的是突变型杂合子，占78.2%，野生型纯合子占21.8%，而突变型纯合子并没有检出。突变型纯合子药物代谢能力强，可致血药浓度偏低，降压效果明显低于野生型纯合子和突变型杂合子，而对于代谢能力偏弱的野生型纯合子EH患者，给予相等剂量药物时可产生不良反应。

目前的研究普遍认为肾素-血管紧张素系统(RAS)在EH发病机制中起着重要作用。ACE是RAS的关键酶，催化血管紧张素Ⅰ转化为生物活性肽和血管紧张素Ⅱ，参与控制体循环血压。ACE基因I/D多态性是高血压发病机制一个独立的危险因素已被证实[9]，LI等[10]对中国21 058人群的Meta分析表明，ACE：I/D的D等位基因与汉族、哈萨克族、藏族和壮族的EH发生相关，但在其他一些少数民族中却没有发现这种相关性。本地区EH人群中以II型及I等位基因所占频率最高，不同于以往的研究结果[10-11]。有研究报道，海南黎族、汉族EH人群ACE：I/D突变也是以II基因型多见[12]。

与ACE类似，ADRB1也作用于RAS，其降压和心血管保护作用相似。该类药物不良反应较小，目前已成为一线降压药物在临床广泛使用。近年来，国内外对ADRB1基因与EH的相关性研究已成为EH候选基因研究的热点之一[13-15]。CHEN等[14]研究发现CC基因型患者对美托洛尔的反应明显优于其他两种基因型(GG型、GC型)。本研究数据显示潮州地区EH人群ADRB1：c.1165G>C的C等位基因频率高达73.8%，提示在使用ADRB1阻滞剂降压治疗时应充分考虑该基因型突变情况。这种基因型(c.1165G>C)对ADRB1阻滞剂敏感，在本地区可以优先选用，但注意药物剂量不要过量，以致血压过低。

AGTR1：c.1166A>C位于3′-UTR非翻译区，CEOLOTTO等[16]对未经治疗的1级高血压患者进行前瞻性研究，结果表明C等位基因型高血压患者miR-155和AGTR1基因转录产物的互补配对结合被干扰，使miR-155对3′-UTR调节区的作用减弱，进一步导致AGTR1基因高表达。NIU 等[17]对16 474例EH人群的Meta分析结果显示，携带AGTR1：c.1166A>C的C等位基因将增加患高血压风险。潮州地区EH人群中AGTR1：c.1166A>C的C等位基因频率为5.8%，此类患者AGTR1敏感性下降，需要适当增加药物剂量才能达到理想的降压效果，而CC纯合子并没有检出。

另一方面，EH药物基因多态性的分布频率与性别是否相关，诸多研究结果不甚一致[18]。彭澍等[19]的研究表明肾素-血管紧张素系统AGTR1、ACE基因位点变异与男性EH的发生有关。另有研究指出女性EH患者的CYP2C9：c.1075A>C、AGTR1：c.1166A>C和CYP2D6：c.100C>T突变率显著高于男性患者[2]。理论上，以上基因不位于X染色体上，因此男女基因频率应该相同。张冬梅等[20]分析了青岛EH患者和健康对照者的ACE：I/D多态性，认为D等位基因与EH的发生相关，尤其是男性患者并与血压的分级相关联。本研究潮州地区男、女性EH患者5个基因多态性位点的等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。有研究指出，这可能与男女性激素水平差异而导致两性间主动脉等大动脉的弹性减退的程度不同有关，还与全身总血容量相关[21]。

EH是最常见的心血管疾病，长期危害人们的生命健康,但由于EH具有高度的遗传异质性，其相关基因在不同群体中会有所不同。潮州地区目前尚少见有关于EH的研究报道，本研究同时分析5个基因多态性位点在潮州地区EH人群中的分布情况，为抗高血压药物的合理使用提供一定的理论依据。