植物种子中氨基酸成分测定方法的比较分析

董玉迪 张 曼 田 娟 孙墨可 郭来春

（吉林省白城市农业科学院 吉林白城 137000）

植物是生态环境中十分重要的组成部分，也是人类重要的食物和营养来源。特别是在植物种子中，富含大量的氨基酸1-α、氨基-γ-（胍基氧基）、正丁酸及其他游离氨基酸，十分有益于人体健康，例如，1-瓜氨酸是非必需氨基酸却时常参与器官间代谢，它也参与一氧化氮信号分子的产生，并且是有效的血管扩张剂。有鉴于此，对植物种子中的游离氨基酸进行分析对于确定植物种子的质量等非常重要[1]。由于氨基酸成分的测定方法很多，在实践中研究人员很难选择出恰当的测定方法，以保障植物种子的氨基酸测定在较大的线性范围内，确保植物种子氨基酸成分测定的精度、准确性和可重复性。因此，迫切需要针对现阶段常用的氨基酸测定方法加以比较。

1 氨基酸成分测定方法

现代氨基酸成分分析测定方法有很多，例如，毛细管电泳、气相色谱、qNMR 和液相色谱等氨基酸成分测定方法[2]。用于氨基酸衍生化的试剂有6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯（AQC）、9-芴基甲基-氯甲酸酯（FMOC-Cl）、异硫氰酸苯酯（PITC）、丹磺酰氯（DNS）和邻苯二甲醛（OPA）。由于酸性、碱性和中性行为及其关键对的存在，氨基酸的分离具有挑战性。关键对紧密洗脱氨基酸衍生物，例如甘氨酸、β-丙氨酸和蛋氨酸。通过RP-HPLC 使用荧光（FLD）、紫外线和二极管阵列检测器（DAD）进行氨基酸测定，通常在柱前衍生化后进行。但是，这些氨基酸成分测定方法或多或少都有弊端。例如，茚三酮虽然是最通用的检测方法，但当需要定量低于100皮摩尔的氨基酸时，其有效性会下降；邻苯二甲醛尽管具有出色的灵敏度，但亚胺酸定量分析效果较差；PTC 化学试剂提供了一种可行的替代方法，但是与样品相关的基质效应会导致谷氨酸和天冬氨酸的回收率可变。

分析氨基酸纯度，同样有许多方法。例如，针对校准物杂质的紫外线检测的高效液相色谱法（HPLC-UV/Vis）或具有火焰离子化检测的气相色谱法（GC-FID）等[3]。但是，这些方法通常会遭受非色谱分离的困扰，导致与杂质相关的巨大不确定性，使得杂质无法得到充分校准，必须再次进行来源或合成然后表征。因此，需要进一步开发用于氨基酸成分测定的方法。通过IEC结合茚三酮进行柱后衍生化测定氨基酸的方法，研究人员研制了全自动仪器，例如，日立L-8800 分析仪和日立L-8900 分析仪等，使这种分析在常规基础上可行，将氨基酸测定提升到新的高度，并应用于许多领域的研究中。此外，将气相色谱仪与同位素比值质谱仪（IRMS）仪器（GC-C-IRMS）连接起来的燃烧接口的概念，允许使用单个加标化合物对多种有机物进行柱后IDMS 分析，来确定同位素标记尖峰的质量流，并且可以在25 ℃下快速进行[4]。

2 氨基酸成分测定方法的比较

2.1 使用方法的比较

使用C 8 色谱柱分离氨基酸，并通过HPLC-FLD 进行氨基酸成分测定需要使用到氨基酸标准品、三水合乙酸钠、盐酸、2-巯基乙醇、HPLC 级甲醇、乙腈、β-丙氨酸和OPA、1-鸟氨酸、冰醋酸、Brij-35、硼酸钠、HPLC 级水。首先将50 mg OPA溶于1.25 mL HPLC级甲醇中，然后将11.1 mL 40 mmol/L 硼酸钠，0.5 mL 3.1%Brij-35 和50 μL 2-巯基乙醇（ME）溶解。

使用HPLC 系统分离氨基酸。通过由Instant Pilot 型号G4208 A 控制的1260 Infinity 荧光检测器进行检测[5]。该系统对PE Nelson 900 接口和PE Nelson 600 链接盒进行了调整。流动相由（A）20 mmol/L 乙酸钠缓冲液和（B）乙腈/甲醇/水（50 /32 /18）组成。通过以下梯度程序实现了28 分钟的氨基酸分离：等度20% B，持续4 分钟，在2分钟内从20%B 逐渐增加到32% B，4 分钟内从32%～34% B 逐渐增加，然后增加3 分钟，从34% B 增至38% B，然后在9 分钟内线性增加至95% B，保持等度5% B 2 分钟，然后在1 分钟内恢复到初始状态20% B 并保持等度4 分钟。流速为0.6 mL / min，进样量为5μL。衍生化过程是自动化的；在进样之前，将100 µL OPA 的等分试样用自动进样器吸收，并添加到含有果汁样品或氨基酸标准溶液的HPLC 小瓶中。将OPA 样品混合物在25±1 ℃下孵育2 分钟。然后立即通过HPLC-FLD 分析反应混合物。为了检测氨基酸，将荧光检测器的激发和发射分别设置在340 nm 和455 nm。

使用NHS-醋酸盐和DEPC 进行氨基酸测定需要使用到NHS-醋酸盐、DEPC、咪唑、用于MS 的所有溶剂和添加剂（HPLC 级）。将15 mmol/L NHS 乙酸酯溶于33%（体积比）乙腈（ACN）中，并用水按1:10 稀释。将PBS中的50 pmol ADH或PK 与0.1%的NHS-乙酸盐混合，最终体积为20 μL，并在23 ℃下孵育15 分钟。随后，添加NuPAGE LDS 样品缓冲液和还原剂，并使用NuPAGE Bis-Tris 凝胶进行凝胶电泳。用NHS-乙酸酯标记的蛋白质在凝胶中水解。为此，从凝胶上切下蛋白条带，然后用10 mmol/L 二硫苏糖醇还原蛋白，用55 mmol/L 碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶（Roche）水解。用水将DEPC 稀释至0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、2.5 mmol/L 和5 mmol/L。将HEPES 中的50 pmol ADH 或PK 与0、2、10、50 和100 摩尔过量的DEPC 混合，并在37 ℃和500 rpm 下孵育1 分钟。通过在冰上添加1μL 10 mmol/L咪唑来终止标记反应。随后，将蛋白质以3 体积沉淀。100%（体积比）冰冷的乙醇和1/10 体积0.5 mol/L 乙酸钠pH 5.3，然后在-20 ℃下孵育2 小时。离心分离蛋白质，并用80%（体积比）乙醇洗涤沉淀，并在真空离心机中干燥。将通过凝胶水解或溶液水解获得的肽溶解在2%（体积比）ACN / 0.1%（体积比）FA 中，并加载到反相C18 预柱浓缩肽。使用0.1% FA（体积比）作为流动相A，使用80%（体积比）ACN / 0.1%（体积比）FA 作为流动相B，然后在反相C18 分析柱上分离多肽，在70 分钟内以300/min 的流速以90%乙醇的梯度洗脱。将这些肽直接洗脱到Q Exactive Plus 混合四极杆Orbitrap 质谱仪中，并以数据依赖模式进行分析。

2.2 测定结果的比较

使用C8 色谱柱分离氨基酸，并通过HPLC-FLD 进行氨基酸成分测定将储备溶液进一步稀释以制成最终浓度为2.5 μg/mL 的溶液。然后将最终浓度依次稀释为0.08μg/ mL、0.16μg/ mL、0.32μg/ mL、0.64μg/ mL、1.28μg/ mL，用于校准曲线。通过注入5μL 连续稀释的标准溶液评估不同氨基酸的校准曲线的线性。通过绘制HPLC 峰面积相对于其浓度的曲线来获得校准图。分别以3 和10 的信噪比（S /N）确定检测限（LOD）和定量限（LOQ）。通过标准氨基酸混合物和样品的重复性和中间精度评估优化该方法的精度。该方法的可重复性通过连续3 天每天从预定的连续进样（n= 5）中获得的单个峰面积的相对标准偏差（%RSD）进行评估。

使用NHS-醋酸盐和DEPC 进行氨基酸测定，在评估标记氨基酸的反应性时，几乎所有的氨基酸都被NHS-乙酸盐和DEPC 标记，这表明氨基酸的反应性很高。从技术角度来看，NHS-乙酸酯标记的可重复性高于观察到的DEPC 标记。相较于以前的结果，在评估赖氨酸残基的标记百分比时，似乎经常在NHS 标记中观察到较高的标记百分比；对于少量氨基酸，使用DEPC 时观察到更高的标记百分比。通过仪器彻底转移缬氨酸的进一步检查，将使用与色谱柱后IDMS 相同的色谱法（但不添加峰）的缬氨酸的碳同位素增量与离线获得的相同同位素增量进行比较。如果这两个同位素δ值之间存在显著差异，则缬氨酸中的少量杂质具有高度异常的同位素δ值，或者在色谱分离过程中存在缬氨酸的分馏现象。

3 结论

植物种子的氨基酸成分测定，关键在于衍生试剂的选择。选择衍生试剂的标准是能与各氨基酸定量反应，每种氨基酸只生成一种化合物且产物有一定的稳定性，不产生或易于排除干扰物；操作简单，色谱分离分辨率高，检测灵敏度高，分析时间短，便于实现自动化和使产物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定。当然，不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序也不尽相同。