琼崖海棠籽油的遗传毒性评价

钟文权，郑联合，邹 易，李豫强，张 威，戴 煌，肖安红

(1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023; 2.湖北省农产品加工与转化重点实验室，武汉 430023; 3.海南省粮油科学研究所，海口 571400)

琼崖海棠(CalophylluminophyllumL.)，又名海棠果、红厚壳、胡桐、海桐、君子树、海棠木，为藤黄科 (Guttiferae) 红厚壳属(Calophyllumgenus) 常绿乔木，喜高温、耐旱热、防海潮、抗强风，在热带沿海作为防风林和护堤林被广泛种植，目前在我国广东、广西、台湾及东南亚、非洲等热带地区均有分布[1]。琼崖海棠籽富含油脂，种仁干基粗脂肪含量为 50%～60%[2]。琼崖海棠籽油的主要脂肪酸为9-十八碳烯酸(27. 67%)、9, 12-十八碳二烯酸(16.78%)、9-十八碳烯酸(E)(13. 54%)、十八碳酸(12.92%)、十六碳酸(10.77%)、11, 14-二十碳二烯酸(7.17%)、正十六碳酸(5.24%)、十七碳酸(5.13%)[3]。在海南，琼崖海棠籽油常被民间用作防腐剂、抗菌剂、收敛药、止疼剂等，用于治疗跌打损伤、外伤出血，减缓关节痛、神经痛等疾病[4-5]。由于琼崖海棠籽中含有具有一定毒性的酚类、香豆素类、黄酮类、三萜类[6]和生物碱[7]等物质，在制油时，这些物质会转移至油中，并使油脂呈深绿色、浑浊、味苦并具有类似中草药特殊气味，所以琼崖海棠籽未作为新食用油料资源进行研发。

为开发琼崖海棠籽作为新的食用油料资源，前期本实验室对琼崖海棠籽毛油和精炼油进行了小鼠急性经口毒性试验，其中琼崖海棠籽毛油急性经口毒性试验采用寇氏法[8]，精炼油采用限量法[8]。结果显示：琼崖海棠籽毛油对雄性小鼠的LD50为 9 217.6 mg/kg，LD50的95%可信限为8 606.4～9 871.3 mg/kg，雌性小鼠的LD50为9 066.4 mg/kg，LD50的95%可信限为8 546.9～9 617.5 mg/kg[9]；琼崖海棠籽精炼油的LD50大于15 000 mg/kg。从而判定琼崖海棠籽毛油毒性级别为实际无毒级，精炼油毒性级别为无毒[8]。在此基础上，本文采用体内与体外试验、体细胞试验与生殖细胞试验相结合的原则，从不同的遗传学终点和靶向的角度，即Ames试验、小鼠骨髓红细胞微核试验和精子畸形试验对琼崖海棠籽毛油的遗传毒性进行了全面评价，以期为海棠籽开发作为新食用油料资源积累基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

琼崖海棠籽毛油，实验室自制，主要理化指标和油脂伴随物含量分别见表1和表2。

试验用昆明种小鼠，清洁级，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。动物合格证号为SCXK(京)2019-0010，使用许可证号为SYXK(鄂)2016-0057。

Gimesa染液、小牛血清，江苏南京建成生物工程研究所；玉米油，中粮福临门食品有限公司；无水乙醇、环磷酰胺、甲醇、磷酸二氢钾、氢氧化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

E3CMOS06300KPA生物显微镜，河南兄弟仪器设备有限公司。

表1 琼崖海棠籽毛油主要理化指标

表2 琼崖海棠籽毛油油脂伴随物含量

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠骨髓红细胞微核试验[10]

选用昆明种健康成年小鼠，体重22～25 g，适应性喂养5 d。根据急性毒理试验结果，按1/8 LD50、1/4 LD50和1/2 LD50分为3个剂量组，雌性分别为1 133.3、2 266.6、4 533.2 mg/kg，雄性分别为1 152.2、2 304.4、4 608.8 mg/kg，以玉米油为阴性对照组(剂量为1/8 LD50)，以环磷酰胺水溶液为阳性对照组(剂量为40 mg/kg)，随机分组，每组10只，每组雌雄各半。0、24 h经口2次灌胃，30 h时颈椎脱臼处死小鼠，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上，混合均匀后推片，自然晾干。按以下操作步骤制片：①浸入99.5%甲醇溶液缸中固定15 min，取出自然晾干；②将固定后的玻片浸入Gimesa染液缸中染色15 min，然后立即用pH为6.8的磷酸盐缓冲液冲洗掉玻片上的染色液，自然晾干，阴凉干燥处保存备检。

将制好的骨髓片先在低倍显微镜下观察，选择细胞完整、分布均匀、染色较好的区域作为检测区域；然后用油镜阅片，观察骨髓嗜多染红细胞、正多染红细胞、含微核细胞并计数。

每只小鼠计数1 000个骨髓嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，观察含微核的嗜多染红细胞数，并计数微核数，计算微核细胞率(微核细胞率=含微核的嗜多染红细胞数/嗜多染红细胞总数×100%)，计数200个细胞中骨髓嗜多染红细胞与正多染红细胞(normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，结果采用U检验法检验结果的差异性。

饲养条件：试验小鼠在19～25℃、相对湿度50%、光照强度130～325 lx、氨质量浓度小于等于20 mg/L、噪声小于等于50 dB环境下分笼饲养，每天上午9点更换饲料、垫料和水并正常饲养，自由采食、饮水。

1.2.2 小鼠精子畸形试验[11]

选用昆明种健康成年雄性小鼠，体重20～35 g，适应性喂养1周，剂量分组、饲养条件均同1.2.1。连续5 d上午9点灌胃，第35天脱臼处死小鼠，取出睾丸附近二侧的附睾器官，放进装有2 mL左右生理盐水(0.9%氯化钠溶液)的平皿里，用眼科剪将洗净的附睾纵向剪1～2刀，静置3～5 min，轻轻摇动，用四层擦镜纸将剪碎的附睾溶液进行过滤，吸滤液进行涂片，在空气中自然干燥后，浸入1%伊红染液缸中染色1 h，再浸入99.5%甲醇溶解缸中5 min左右，取出自然晾干，1 h后用蒸馏水轻轻地冲掉染液，自然晾干，阴凉干燥处保存备检。

首先在低倍显微镜下找到背景比较清晰而且精子重叠比较少的区域为受检区域，然后再用高倍显微镜按从左到右和从上到下的顺序逐个检查并记录精子的形态，其中无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头等为畸形精子。每只试验动物以1 000个结构完整的精子为基数，计数精子畸形数，计算精子畸形率，并采用Wilcoson秩和检验法检验进行显著性分析。

1.2.3 Ames试验[12]

依照GB 15193.4—2014《食品安全国家标准 细菌回复突变试验》中平板掺入法进行。试验分琼崖海棠籽毛油组、溶剂对照组(二甲基亚砜)、阳性对照组和空白对照组(不添加受试物)，阳性诱变剂采用敌克松(TA97、TA98, 不加S9)、甲基磺酸甲酯(TA100、TA102, 不加S9)、2-氨基芴(TA97、TA98、TA100, 加S9) 及1,8-二羟基蒽醌(TA102, 加S9)。

选用鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，经鉴定合格后开展试验。活化系统为多氯联苯诱导的大鼠肝S9, 蛋白质含量为37.5 mg/mL, 其对2-氨基芴具良好代谢激活能力，每100 mL S9混合液中加入10 mL S9。

由于受试物对菌株无细菌毒性，设置受试物的最高剂量为5 μL/皿(约4 647 μg/皿)，在加与不加S9混合液的情况下，分两次试验，第一次以5.0、2.5、1.3、0.6 μL/皿及0.3 μL/皿剂量进行试验，第二次以5.0、1.0、0.2、0.04 μL/皿及0.008 μL/皿剂量进行试验，每个剂量设3个平行。受试样品的称量和配制均在无菌条件下进行，受试样品用二甲基亚砜溶解配制成50 μL/mL高剂量组，以下8个剂量组分别用二甲基亚砜逐级稀释，加样量均为0.1 mL/皿。在2 mL顶层培养基中加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL 受试样品溶液和0.5 mL S9混合液(当需要活化时)。混匀后迅速倾注在底层培养基上，37℃培养48 h，计数每皿回变菌落数，当受试物菌落回变数超过自发回变数的2倍以上并有剂量反应关系时判定为阳性。

2 结果与讨论

2.1 小鼠骨髓红细胞微核试验结果(见表3)

表3 小鼠骨髓红细胞微核试验结果

由表3可知，雌性和雄性小鼠阴性对照组微核细胞率分别为0.26%和0.24%，小于0.5%[10]，阳性对照组的微核细胞率相对阴性对照组存在极显著差异(P<0.01)，说明阴性对照组可选择玉米油进行试验。琼崖海棠籽毛油低、中、高剂量组均会引起小鼠发生微核突变，低剂量组相对阴性对照组均不存在显著性差异；中、高剂量组相对阴性对照组存在极显著差异(P<0.01)，且随着剂量的增加，微核细胞率呈逐渐上升的趋势，有明显的剂量-反应关系[10]，结果显示阳性。

2.2 小鼠精子畸形试验(见表4)

由表4可见，阴性对照组的精子畸形率为2.19%，在0.8%～3.4%[11]范围内，中、高剂量组相对阴性对照组存在极显著差异(P<0.01)，且随着剂量的增加，精子畸形率呈逐渐上升的趋势，有剂量-反应关系[11]，为阳性结果。

表4 小鼠精子畸形试验结果

2.3 Ames试验结果(见表5、表6)

琼崖海棠籽毛油两次细菌回复突变试验，平板上菌株生长良好，未观察到污染菌落。由表5和表6可知：空白对照组的试验结果表明4种菌株的自发回变菌落数与GB 15193.4—2014和文献[13-14]报道一致，结合菌株鉴定结果，表明菌株状态正常；阳性对照组的回变菌落数显著高于自发突变，表明阳性诱变剂有效。将不同剂量的受试物样品组与溶剂对照组的结果进行比较，结果表明，在添加与不添加S9混合物情况下，两次试验中所有剂量的受试物样品组的回变菌落数均未超过溶剂对照组回变菌落数的2倍，且无剂量-反应关系。说明受试物琼崖海棠籽毛油对鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株TA97、TA98、TA100及TA102 4株试验菌株，在添加与不添加S9混合物情况下，均未观察到致基因突变作用。

表5 Ames试验结果(第一次)

表6 Ames试验结果(第二次)

2.4 讨论

遗传终点具有多样化特性，本研究采用Ames试验、小鼠精子畸形试验和小鼠骨髓红细胞微核试验组合检测多个遗传终点。Ames试验是检测基因突变的体外试验，利用鼠伤寒沙门氏菌的突变营养缺陷菌株为指示物，检测DNA碱基序列是否改变。小鼠精子畸形试验检测受试物对精子不同发育阶段的影响，评价生殖细胞的受损情况。小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遗传性，许多染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。精子畸形主要是指形态的异常，已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此，形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变，说明环境因子对精子生成、发育有影响。小鼠骨髓红细胞微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。有很多化学物质能引起染色体的异常。染色体是遗传物质的载体并含有生物体全部的遗传信息，染色体遗传信息的异常可不同程度地影响生物机体的生存，轻者突变，重者死亡。染色体仅出现微小的异常变化，都可能对人体健康产生非常严重的影响。

本实验室前期经口急性毒性试验结果显示琼崖海棠籽毛油属于实际无毒，精炼油属于无毒。在遗传毒性试验中，琼崖海棠籽毛油各剂量组在Ames试验(鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102)中结果均为阴性，表明琼崖海棠籽毛油在体外试验中未发现致突变作用。在小鼠骨髓红细胞微核试验中，与阴性对照组相比，琼崖海棠籽毛油中、高剂量组微核细胞率存在极显著差异(P<0.01)，有明显的剂量-反应关系，为阳性结果，引起染色体异常。在小鼠精子畸形试验中，相对阴性对照组，琼崖海棠籽毛油中、高剂量组精子畸形率存在极显著差异(P<0.01)，有剂量-反应关系，结果也为阳性，对决定精子形成的基因发生了突变。

目前，对于琼崖海棠籽毛油中存在的化学成分未完全分析鉴定清楚，根据目前国外学者对红厚壳属植物的叶、茎、根、皮、种子等部位的化学成分进行分析研究结果推断，琼崖海棠籽毛油中可能有呫吨酮类、香豆素类、黄酮类、萜类[7]、酚类、生物碱类等多种化合物存在。其中呫吨酮类包括Calozeylo-xanthone、1,5-Dihydroxyxanthone、6-Deoxyjacareubin和Caledonixanthone等[6]，香豆素类包括Inophyllum A、B、C、D和Calophyllolide等[6]，黄酮类包括Amentoflavone、Biflavanone和Pyranoamentoflavone等[6]，萜类包括Canophyllal、Canophyllol和Taraxerone等[6]。本研究测定了琼崖海棠籽毛油中黄酮、三萜、总酚、香豆素和生物碱含量(见表2)，这些成分有些具有一定的毒性。Oodyke[15]研究结果显示，香豆素类对大鼠口服LD50为293 mg/kg，按照我国化合物经口急性毒性分级标准[16]中的毒性分级判定可知，香豆素为中等毒性。香豆素类化合物在高剂量时具有遗传毒性和肝脏毒性等[17]。由此可以推断，琼崖海棠籽毛油的小鼠骨髓红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验为阳性，可能与其含有呫吨酮类、香豆素类、萜类和生物碱类等化学物质有关。

物质的毒性不仅与物质的本身性质有关，也与摄入该物质的剂量有关。若按照体重50 kg的成年人每人每天油脂的摄入量25～30 g[18]计算，则琼崖海棠籽毛油或精炼油的摄入剂量为500～600 mg/kg，低于琼崖海棠籽毛油小鼠骨髓红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验阴性结果的低剂量1 133.2 mg/kg(雌性)和1 152.2 mg/kg(雄性)。由此，可推断对于琼崖海棠籽毛油在推荐摄入剂量(500 ～ 600 mg/kg)时对受试物不具遗传毒性。

3 结 论

琼崖海棠籽毛油的小鼠骨髓红细胞微核试验和精子畸形试验的中、高剂量组为阳性结果；Ames试验结果均为阴性。琼崖海棠籽毛油中所含呫吨酮类、香豆素类、萜类和生物碱等化学物质可能是遗传毒性为阳性的原因。小鼠骨髓红细胞微核试验、精子畸形试验为阴性结果的低剂量，高于推荐油脂摄入量，说明在推荐油脂摄入量下，琼崖海棠籽毛油对受试物不具遗传毒性。