二甲双胍通过IGF-1/PI3K/Akt信号通路对细胞衰老的影响

侯玉丽 付静轩 王培昌

[摘要] 目的 探讨二甲双胍（Met）通过IGF-1/PI3K/Akt信号通路对细胞衰老的影响。 方法 选取2BS细胞分成四组，即对照（NC）组、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）组、Met组、Met+IGF-1组。加药处理后进行SA-β-Gal染色检测细胞衰老水平、CCK8试验检测细胞增殖能力、EdU试验检测DNA合成能力以及Western blot检测各组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达。 结果 各组SA-β-Gal染色阳性率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。Met+IGF-1组SA-β-Gal染色阳性率低于IGF-1组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。在相同时间点，Met+IGF-1组OD450值高于IGF-1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。EdU染色后在370 nm处的染色结果显示，各组OD370值比较，差異有统计学意义（P < 0.05）;Met+IGF-1组OD370值高于IGF-1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。Met组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量低于其他组，差异有统计学意义（P < 0.05）。IGF-1组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量高于其他组，差异有统计学意义（P < 0.05）。Met+IGF-1组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量低于IGF-1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 Met可通过抑制IGF-1/PI3K/Akt信号通路来延缓细胞衰老。

[关键词] 二甲双胍;2BS细胞;胰岛素样生长因子1;PI3K/Akt信号通路;细胞衰老

[中图分类号] R730          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）10（b）-0009-04

[Abstract] Objective To explore the effect of metformin （Met） on cell senescence through IGF-1/PI3K/Akt signaling pathway. Methods 2BS cells were selected and divided into four groups， namely control （NC） group， insulin-like growth factor-1 （IGF-1） group， Met group， Met+ IGF-1 group. After drug treatment， SA-β-Gal staining was performed to detect cell senescence， CCK8 test was used to detect cell proliferation ability， EdU test was performed to detect DNA synthesis ability， and Western blot  was used to detect the protein expression of PI3K， p-PI3K， Akt， and p-Akt in each group. Results The positive rate of SA-β-Gal staining in each group was compared， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive rate of SA-β-Gal staining in Met+IGF-1 group was lower than that in IGF-1 group， and the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. At the same time point， the OD450 value of the Met+IGF-1 group was higher than that of the IGF-1 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The staining results at 370 nm after EdU staining showed that the OD370 value of each group was compared with statistical significance （P < 0.05）; the OD370 value of the Met+IGF-1 group was higher than that of the IGF-1 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The expressions of p-PI3K and p-Akt protein in Met group were lower than those in other groups， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expression of p-PI3K and p-Akt protein in IGF-1 group were higher than those in other groups， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expressions of p-PI3K and p-Akt protein in Met+IGF-1 group were lower than those in IGF-1 group， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Metformin can delay cell senescence by inhibiting IGF-1/PI3K/Akt signaling pathway.

[Key words] Metformin; 2BS cells; Insulin-like growth factor 1; PI3K/Akt signaling pathway; Cell senescence

伴随着人口数量的增长和生活水平的提高，社会正在迅速老龄化，老龄化也是大多数慢性病的主要危险因素[1-3]。二甲双胍（Metformin，Met）作为治疗2型糖尿病的一线用药，通过增强胰岛素敏感性、诱导糖酵解、抑制肝脏糖异生、稳定血糖发挥作用[4]。胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）与受体结合通过 PI3K/Akt信号通路调节细胞过程，包括细胞增殖、代谢、分化、衰老和凋亡等[5-6]。最近研究显示[7]，Met可以抑制mTOR的激活延缓衰老的进展，但对IGF-1诱导的PI3K/Akt通路的作用机制尚不清楚。因此，本研究通过培养衰老典型细胞2BS，外源性添加Met和IGF-1，检测2BS细胞衰老指标的变化，探究Met对IGF-1诱导的PI3K/Akt通路的影响，为延缓衰老提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器  CO2培养箱（Thermo Scientific，Forma 371，美国）、多功能酶标分析系统（Tecan Infinite F200，奥地利）和倒置荧光显微镜（LeicaCTR4000，德国，Leica）等。

1.1.2 试剂  MEM培养基（11095080，Gibco）;BCA蛋白定量试剂盒（A53226，ThermoFisher）;RIPA（R0010，索莱宝）;β-actin（AF5001）、HRP标记二抗（A0208）、CCK8试剂盒（C0037）、EdU细胞增殖检测试剂盒（C0088S）、SA-β-Gal染色试剂盒（C0602）购于上海碧云天生物技术有限公司;PI3K（ab32089）、p-PI3K（ab182651）、Akt（ab179463）、p-Akt（ab8805）购于Abcam;Met（HY-B0627，MCE）;IGF-1（8917，CST）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培养  2BS细胞购自中国科学院细胞库，培养条件为MEM培养基加10%FBS和1%青链霉素双抗，于37℃、5%CO2培养。

1.2.2 细胞分组与处理  传代细胞随机分成四组，分别为对照（NC）组、Met组、IGF-1组、Met+IGF-1组。NC组细胞无血清培养24 h后收集蛋白;Met组无血清培养24 h后，加入4 mmol/L Met作用24 h收集蛋白;IGF-1组无血清培养24 h后加入100 ng/mL IGF-1 30 min后收集蛋白;Met+IGF-1组无血清培养24 h后加入4 mmol/L Met作用24 h后加入100 ng/mL IGF-1培养30 min后收集蛋白。

1.2.3 细胞衰老半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色  吸除细胞培养液，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min;吸除固定液，加入1 mL染色工作液，放置于37℃恒温箱中孵育过夜。镜下观察染色，衰老细胞呈深蓝色，阴性细胞无着色。各组随机计数100个细胞中的阳性细胞数，计算阳性细胞率（%），实验独立重复3次。

1.2.4 CCK8细胞增殖试验  将34代2BS细胞按每孔10 μL 2000个细胞传代至96孔板中，贴壁后加入不同药物处理，每孔加入100 μL培养基和10 μL CCK-8溶液，孵育1.5 h，连续监测5 d，实验独立重复3次。

1.2.5 EdU细胞增殖试验  在细胞培养液中加入EdU工作液孵育2 h。去除工作液，加入1 mL固定液，室温15 min后洗涤。加入1 mL通透液，室温15 min后洗涤。再用内源性过氧化物酶封闭液室温孵育20 min，随后洗涤，加入EdU显色液进行检测，实验独立重复3次。

1.2.6 Western blot  用100 μL RIPA裂解细胞，冰上静置30 min，离心半径10 cm，12 000 r/min离心10 min，吸取上清。蛋白电泳条带转移至PVDF膜后以1∶1000稀释的一抗在4℃条件下震荡孵育过夜。以1∶5000稀释的二抗室温孵育1 h，TBST漂洗后，ECL显色，结果用凝胶成像系统照相保存。β-actin作为内参，实验独立重复3次。

1.3 统计学方法

用Graph Pad Prism 5软件，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，三组及以上比较采用方差分析或重复方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SA-β-Gal染色阳性率比较

NC组SA-β-Gal染色阳性率为（69.33±2.40）%，Met组为（34.67±4.37）%，IGF-1组为（86.00±3.46）%，Met+IGF-1组（53.33±3.53）%。各组SA-β-Gal染色阳性率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。Met+IGF-1组SA-β-Gal染色阳性率低于IGF-1组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。各组细胞的SA-β-Gal染色和阳性率结果见图1。

2.2 CCK8细胞增殖能力比较

在相同时间点，Met组OD450值最高，IGF-1组OD450值最低，Met+IGF-1组OD450值高于IGF-1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组细胞连续5 d增殖曲线见图2。

2.3 EdU细胞DNA合成能力比较

EdU染色后在370 nm处的染色结果显示，Met组OD370值最高，IGF-1组OD370值最低，差异有统计学意义（P < 0.05）;Met+IGF-1组OD370值高于IGF-1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组细胞EdU染色结果见图3。

2.4 Western blot检测各组细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt的蛋白水平

四组PI3K、Akt蛋白表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。Met组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量低于NC组、IGF-1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。IGF-1组p-PI3K、p-Akt蛋白表达量高于NC组及Met+IGF-1组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

3 讨论

衰老的特点是细胞形态和衰老相关基因的一系列特殊变化[8]。衰老时相关基因及通路发生改变导致衰老表型的出现[9]。研究提示高血糖和高胰岛素血症是衰老的重要因素[10]，高糖状态通过抑制细胞增殖、细胞存活能力而促进细胞衰老[11]。高糖状态下IGF-1因子分泌增多，通过PI3K/Akt/mTOR信号通路进行细胞功能的调控[12]。在蠕虫、昆虫和哺乳动物的研究显示[13-14]，IGF-1/PI3K/Akt信号通路参与细胞衰老的调控。在小鼠中，将IGF-1受体突变后，小鼠寿命延长。在肥胖症患者和转基因小鼠中，IGF-1高表达的同时老龄病的发病率升高，寿命缩短[15]。降糖药Met可以降低血糖、提高葡萄糖利用率，同时还可以通过抑制IGF-1信号通路来对糖尿病患者进行治疗[16-17]。在果蝇中，高浓度Met喂养可以延长果蝇寿命，同样的结果在蠕虫、大鼠和兔子中被发现[18]。本实验从细胞水平和信号传导水平研究Met在衰老中的作用机制。

本研究显示，2BS细胞经Met刺激后，SA-β-Gal染色水平显著降低，细胞增殖能力升高、DNA合成能力增强，提示Met可以延缓细胞衰老。除此之外，Met还可以使p-PI3K、p-Akt表达降低，抑制PI3K/Akt信号通路的活化。2BS细胞加入IGF-1刺激后，SA-β-gal染色阳性率显著升高，细胞增殖能力和DNA合成能力减弱。Western blot结果显示，IGF-1刺激后PI3K和Akt水平不變，p-PI3K和p-Akt水平升高，提示IGF-1可以刺激下游的PI3K/Akt信号通路，使PI3K磷酸化为p-PI3K，Akt活化为p-Akt而发挥作用。提示IGF-1可以通过激活PI3K/Akt信号通路来促进细胞衰老，这与其他研究结果相一致[19-20]。进一步研究发现，Met+IGF-1组SA-β-gal染色水平低于IGF-1组，细胞增殖能力和DNA合成水平高于IGF-1组，并且p-PI3K、p-Akt蛋白表达水平也低于IGF-1组，提示Met可以从一定程度上抑制IGF-1介导的PI3K/Akt信号通路，从而延缓衰老。

本实验显示，Met可以通过抑制IGF-1介导的PI3K/Akt信号通路来延缓衰老，这为延缓衰老提供了新的实验思路。然而，影响衰老的因子以及通路众多，本实验未研究Met对衰老影响涉及的所有通路，因此，需要进一步研究来完善Met对衰老影响的其他可能机制。

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（收稿日期：2020-02-20）