福建3类陈年老茶有机酸组分及含量比较分析

刘文静 傅建炜 何明燕

摘要：采用反相高效液相色谱法分析比较乌龙茶、红茶和白茶的陈年老茶中有机酸的成分及含量。茶叶样品用纯水提取后利用Titank C18色谱柱进行分离，以磷酸盐缓冲液（pH值为2.40）-甲醇作为流动相，用二极管阵列检测器（波长214 nm）进行检测，柱温为30 ℃，流速为0.8 mL/min。结果表明，10种有机酸标准曲线相关系数均在0.999 0以上，平均回收率为90.0%～96.5%，相对标准偏差≤2.1%。测得的有机酸中，10、5年陈乌龙茶、红茶和白茶老茶中的马来酸含量均最低。10年陈乌龙茶中含量最高的为苹果酸，红茶及白茶牡丹、白茶寿眉的奎尼酸含量最高，白茶贡眉中含量最高的为草酸。5年陈乌龙茶中老枞水仙、大红袍的苹果酸含量最高，而金佛茶中酒石酸的含量最高，功夫红茶、白茶牡丹和白茶贡眉中含量最高的有机酸均为奎尼酸。研究还发现，在不同种类甚至同一种类不同品种的陈年老茶中，各种有机酸含量存在较大差异：在10年陈茶中，乌龙茶的草酸含量低于红茶、白茶，而在乌龙茶中，龙凤熟茶的马来酸含量明显高于其他2种乌龙茶，鸡纳酸含量相比最低;在5年陈茶中，乌龙茶的奎尼酸含量低于红茶、白茶，白茶中的牡丹除草酸含量略低外，其余5种有机酸含量均高于贡眉，其中马来酸、奎尼酸和酒石酸的含量差异在牡丹与贡眉间达极显著水平（P<0.01）。

关键词：反相高效液相色谱法;陈年老茶;有机酸组分;有机酸含量;回归分析

中图分类号： TS272.7  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）20-0224-05

茶是世界三大饮料之一，因其对人体具有一定的保健功效而深受推崇。明代顾元庆在《茶谱》中记述“人饮真茶能止渴、消食、除痰、少睡、利尿道、明目、益思、除烦、去腻，人固不可一日无茶”[1]。由此可见，虽然古人对茶的成分并不了解，但他们已经认识到喝茶的好处及茶叶的药用价值。研究发现，茶叶中含有茶多酚、茶氨酸、多糖、有机酸等多种活性成分。目前，关于茶叶中茶多酚[2-3]、茶氨酸[4]、多糖[5]等的报道较多，有机酸是茶叶品质成分的重要组分，在一些化学反应中常作为碳水化合物分解的中间产物，但是目前国内外关于茶叶中有机酸的分析和研究还不多[6]。

有机酸是指含有1个或多个羧基基团的有机化合物，包括芳香族有机酸与脂肪酸。目前，茶叶（汤）中已经发现的有机酸有40余种，其中茶汤中的有机酸有10余种[7]，主要有柠檬酸、绿原酸、草酸、抗坏血酸、阿魏酸及没食子酸等，约占茶叶中干物质含量的3%[8]。有机酸参与茶树的新陈代谢，是茶叶化学品质的主要成分之一[9]。目前，已有关于不同品种茶叶（如红茶[10]、茯砖茶[11]、紧压茶[12]、绿茶[13]、白茶[14]等）中有机酸检测的研究，但未见对存放时间较长的陈年老茶中有机酸含量及成分进行比较分析的报道。

在茶叶储藏的过程中，有机酸种类与含量的变化会对茶叶的香气和滋味产生不同程度的影响。在长时间存放的过程中，祁门红茶的酸类物质总量呈增加的态势，但是各有机酸组分含量均有所改变，如草酸、乙酸等物质的含量呈增加趋势，而柠檬酸含量下降至0.29%，其含量的降低对茶汤滋味的影响较大[15];在存储过程中，黑毛茶的各有机酸组分含量呈波浪状变化，无明显规律[16]。由此可见，不同品种茶叶的陈年老茶有机酸含量具有一定差异，因此有必要对陈年老茶中的有机酸含量进行检测分析。

本研究以从福建省各茶叶店、超市及茶厂采购的陈年老茶为研究对象，综合前人对茶叶中有机酸含量测定方法的研究，建立反相高效液相色谱法测定老茶中有机酸组分的检测方法，比较分析红茶、白茶和乌龙茶等3个类型陈年老茶的有机酸含量，以期为陈年老茶的品质分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

陈年老茶，购自福建省各茶叶店、超市及茶厂。

1.2 试验仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，购自美国Waters公司;Waters 2998二极管阵列检测器，购自美国Waters公司;Empower色谱工作站，购自美国Waters公司;Millipore Direct-Q5超纯水仪，购自美国Millipore公司;KQ5200DV超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司;TDL-5-A离心机，购自上海安亭科学仪器厂;HD-2500多管旋涡混合器，购自杭州佑宁仪器有限公司;pH计，购自上海埃依琪实业有限公司;微量可调移液器，购自德国Eppendorf公司。

1.3 试剂及配制

1.3.1 试剂 磷酸（分析纯），购自西陇化工股份有限公司;磷酸二氢钾（分析纯），购自西陇化工股份有限公司;纯度为98%的草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、鸡纳酸、乙酸、乳酸、马来酸、琥珀酸、奎尼酸等，均购自上海康朗生物科技有限公司。试验用水用Millipore Direct-Q5超純水仪制备。

1.3.2 溶液的配制 0.04 mol/L KH2PO4-H3PO4 缓冲溶液：称取5.44 g KH2PO4，用超纯水溶解并定容至1 000 mL，用85%磷酸溶液调节pH值至2.40，用0.45 μm孔径的水相滤膜过滤，用超声波脱气1 min。

有机酸标准溶液的配制：准确称取马来酸、草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、奎尼酸、鸡纳酸，分别置于10 mL棕色容量瓶中，用超纯水溶解并定容，分别配制成质量浓度为5.42、5.01、5.03、540、5.30、5.03、2.06、5.07 mg/mL的标准储备液;称取乙酸、乳酸各5.00 g，分别置于50 mL棕色容量瓶中，用超纯水溶解并定容，配制成质量浓度为100 mg/mL 的标准储备液。将上述溶液稀释成不同浓度，检测并绘制各种有机酸的标准曲线，以峰面积对浓度进行线性回归分析。

1.4 色谱条件

色谱柱型号为Titank C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm;流动相：0.04 mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲溶液，pH值为2.40，流速为0.8 mL/min，柱温为 30 ℃，进样量为10 μL;检测器为2998 PDA Dedector紫外检测器，检测波长为214 nm。

1.5 样品处理

将茶叶磨成粉状后称取2.00 g置于50 mL离心管中，用超纯水定容至30 mL，涡旋处理1 min，超声提取30 min，5 000 r/min高速离心10 min。取滤液，过0.45 μm孔径的滤膜，进样体积为10 μL。

1.6 回收率、精密度的测定

在已知有机酸含量的茶叶样品中添加3份不同质量浓度的有机酸混合标准液，每份质量浓度设6次平行，涡旋混匀5 min后，静置10 min，按照“1.5”节中样品处理方法进行处理后，再按照“1.4”节中的色谱条件进行分析，计算10种有机酸的加标回收率和精密度。

2 结果与分析

2.1 有机酸标准品的色谱分析及回归分析

如图1所示，10种有机酸标准品在色谱分离过程中均表现出较好的峰型。

分别用各成分的峰面积（y）对应各标准工作液的质量浓度（x，μg/mL）绘制标准曲线，回归方程、相关系数见表1。由表1可以看出，8种有机酸标准品在线性范围内均有较好的拟合程度。

2.2 精密度与回收率

由表2可知，10种有机酸在不同质量浓度添加水平下的平均回收率均高于90.0%，并且除了鸡纳酸添加质量浓度为2 μg/mL时的相对标准偏差（RSD）为2.1%外，其他RSD均在2.0%以下，说明该方法具有较高的准确度与精密度，符合分析要求。

2.3 10年陈茶中有机酸含量的测定结果

由表3可以看出，各个品种陈茶中均未检出乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸;在测得的6种有机酸中，马来酸含量均最低;在3种乌龙茶中，含量最高的均为苹果酸;在红茶及白茶牡丹、白茶寿眉中，奎尼酸含量最高，在白茶贡眉中含量最高的为草酸。

对不同品种10年陈茶的有机酸含量进行比较可知，乌龙茶中的草酸含量低于红茶、白茶，与白茶中草酸含量相比差异极显著（P<0.01）;在3种白茶中，贡眉的草酸含量最高（290.0 mg/100 g），与其余2种白茶相比差异极显著（P<0.01）。乌龙茶中龙凤熟茶的马来酸含量（10.5 mg/100 g）为所有样品中最高的，与其他样品差异极显著（P<0.01）;功夫红茶中的马来酸含量最低（1.1 mg/100 g），但与除龙凤熟茶外的几种茶叶相比，差异均未达极显著水平;3种白茶中的马来酸含量较为接近，为2.1～3.3 mg/100 g。对不同品种茶叶中的鸡纳酸含量进行比较发现，乌龙茶中龙凤熟茶的雞纳酸含量低于老枞水仙和金佛，差异极显著（P<0.01）;3种白茶中的鸡纳酸含量极显著（P<0.01）低于功夫红茶、老枞水仙和金佛，而后三者之间的差异不显著，可见白茶相比于乌龙茶、红茶，其鸡纳酸含量较低。同类但不同品种的陈年老茶中的苹果酸含量表现出较大差异，乌龙茶中金佛的苹果酸含量（493.1 mg/100 g）最高，其次为老枞水仙的苹果酸含量（292.8 mg/100 g），龙凤熟茶的苹果酸含量（165.8 mg/100 g）最低，它们之间的差异均达极显著水平（P<0.01）;白茶中寿眉的苹果酸含量最高（304.6 mg/100 g），与牡丹、贡眉相比差异显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）;功夫红茶的苹果酸含量（348.7 mg/100 g）仅次于乌龙茶中金佛的苹果酸含量，高于所有白茶的苹果酸含量。对茶叶样品中奎尼酸含量的检测结果表明，龙凤熟茶中的奎尼酸含量（46.5 mg/100 g）远低于其他样品（P<0.01）;功夫红茶中的奎尼酸含量最高（486.6 mg/100 g），为龙凤熟茶的10倍以上。在3种乌龙茶中，老枞水仙的酒石酸含量最低（31.9 mg/100 g），与白茶贡眉（33.2 mg/100 g）相当，而其余2种乌龙茶（龙凤熟茶和金佛）中的酒石酸含量接近，分别为152.6、152.3 mg/100 g，远高于其他茶叶样品中的酒石酸含量（P<0.01）;白茶牡丹、寿眉和功夫红茶的酒石酸含量差异不显著。

2.4 5年陈茶中有机酸含量的测定结果

由表4可知，与10年陈茶一致，在所有茶叶样品中均未检出乙酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸;在检出的6种有机酸中，马来酸含量均最低;在各茶叶品种中，5年陈茶中含量最高的有机酸与10年陈茶中略有不同。在乌龙茶中，老枞水仙、大红袍的苹果酸含量最高;而在2种金佛茶中，酒石酸含量最高;在功夫红茶、牡丹、贡眉中，含量最高的均为奎尼酸。

对不同品种5年陈茶的有机酸含量比较可知，乌龙茶中的金佛（散茶）、金佛（茶饼）和大红袍的草酸含量较低，相比含量最高的2种白茶（牡丹、贡眉），草酸含量的差异达极显著水平（P<0.01）;在乌龙茶中，老枞水仙的草酸含量也低于其他2种白茶，差异显著（P<0.05）。在功夫红茶中，马来酸含量（0.7 mg/100 g）最低，而白茶中牡丹的马来酸含量最高（10.2 mg/100 g），与其他样品相比差异均极显著（P<0.01）。

功夫红茶的鸡纳酸含量（56.6 mg/100 g）极显著高于其他茶叶样品（P<0.01）;白茶中的鸡纳酸含量较低，极显著低于乌龙茶老枞水仙和大红袍（P<0.01），但与乌龙茶金佛（散茶）、金佛（茶饼）间的差异不显著。金佛（茶饼）中的苹果酸含量最低，其余样品中的苹果酸含量略有差异，但差异未达极显著水平。功夫红茶中的奎尼酸含量最高（557.8 mg/100 g），其次为白茶牡丹（474.9 mg/100 g），二者的奎尼酸含量均极显著高于乌龙茶（P<0.01）;乌龙茶中金佛（散茶）、金佛（茶饼）和大红袍的酒石酸含量则极显著高于红茶和白茶（P<0.01）。

3 讨论与结论

目前关于茶叶中有机酸的研究相对较少，本研究综合前人对茶叶中有机酸含量测定方法的研究，建立了测定5、10年陈茶中有机酸含量的反相高效液相色谱法。结果显示，检测获得的各类有机酸标准品具有较高的分离度，线性回归方程的相关系数均>0.999，回收率在90.0%及以上，且RSD≤21%，说明该方法具有较好的回收率及精密度。由于茶叶复杂的成分对有机酸测定具有较大干扰作用，因而用本试验中的方法未能定量检测出茶叶中的琥珀酸、乙酸、柠檬酸和乳酸。

制茶工艺对茶叶中的有机酸含量具有一定影响。谢旻皓等研究发现，发酵体系中的微生物对于提高有机酸代谢产物含量具有一定作用[17];屠幼英等研究发现，经微生物发酵的茶叶中的总有机酸量大于非发酵茶[18]。红茶属于全发酵茶，乌龙茶属于半发酵茶，白茶属于微发酵茶，由此可以推测，茶叶中有机酸含量的差异可能与其工艺中的发酵过程有关。本研究通过检测发现，在不同种类甚至同一种类、不同处理的陈年老茶中，各种有机酸含量存在较大差异，10年陈乌龙茶中的草酸含量低于红茶、白茶;此外，乌龙茶中龙凤熟茶的马来酸含量明显高于其他2种乌龙茶，而鸡纳酸含量相比最低。在5年陈老茶中，乌龙茶的奎尼酸含量相对低于红茶、白茶;白茶中的牡丹除草酸含量略低外，其余5种有机酸含量均高于贡眉，其中马来酸、奎尼酸和酒石酸含量的差异均达极显著水平（P<0.01）。

茶叶在陈化过程中，部分大分子物质逐渐氧化、降解，一些小分子物质会聚合或氧化，各种色素物质和呈味物质产生重组，从而表现出与新茶不同的感官品质[19]。刘盼盼等研究不同叶位、不同品种和不同种类茶叶中的有机酸含量发现，有机酸含量随着鲜叶嫩度的下降而降低[8];赵和涛研究发现，红茶经过萎凋、揉捻、发酵等加工工序后，有机酸总量呈增长趋势，直至干燥时才有所降低[20]。谢娇枚等对祁门红茶进行品质分析发现，在长时间的存放过程中，祁门红茶的酸类物质总量明显增加，但是各有机酸组分含量均有所改变[15]。本研究通过检测5、10年陈茶中的有机酸，未发现有机酸含量与贮藏年份的相关性，推测其原因，主要由于检测的2种年份的茶不是同一批次贮藏的，同时部分茶叶样品在贮藏过程中经过了复焙，因此随贮藏年份变化，有机酸含量未发现明显的变化规律。

茶叶陈化后的品质表现与原料品质、环境条件及贮存时间等多方面的因素有关[21]，国内关于对茶叶陈化机制的研究还很有限，需要大量试验与分析来验证陈年老茶越陈越香的确切标准。有机酸作为茶叶重要的成分之一，对其定性与定量分析是陈年老茶品质调控必不可少的内容，具有重要意义。

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