象草ITS2序列的克隆与比较分析

蔡升 杨平 续晨 蔡小宁

摘要    从象草叶片提取了DNA，进行PCR扩增，获得了一段长度为283bp的ITS2序列。不同物种间ITS2序列的系统发育分析表明，象草与玉米的亲缘关系最近，属于单子叶植物类群。与GenBank中其他来源的ITS2序列进行比较分析，发现多条ITS2序列之间存在少量碱基的差异。针对这种情况，提出可以采用“基准”ITS2序列作为解决办法。

关键词    象草;“基准”ITS2序列;克隆

中图分类号    Q943.2        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）21-0220-02                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Cloning  and  Comparative  Analysis  of  ITS2  Sequence  of  Pennisetum  purpureum

CAI Sheng 1，2    YANG Ping 1    XU Chen 1    CAI Xiao-ning 1 *

（1 College of Food Science， Nanjing Xiaozhuang University， Nanjing Jiangsu 211171; 2 College of Agriculture， Nanjing Agricultural University， Nanjing Jiangsu 210095）

Abstract    DNA was extracted from Pennisetum purpureum leaves and amplified by PCR， and an ITS2 sequence with length of 283bp was obtained. Phylogenetic analysis of ITS2 sequences among different species showed that Pennisetum purpureum and corn had the closest genetic relationship and belonged to the monocotyledonous group. Compared with ITS2 sequences from other sources in GenBank， it was found that there were a few base differences among multiple ITS2 sequences. In view of this situation， it was proposed that the "benchmark" ITS2 sequence could be used as a solution.

Keywords    Pennisetum purpureum; "benchmark" ITS2 sequence; cloning

象草（Pennisetum purpureum）是一种新型的高产高蛋白牧草，具有适应性强、繁殖快、产量高、质量好、利用周期长等特点，有较高的营养价值，柔软多汁，适口性好，牛、羊、鹅等畜禽均喜食，幼嫩时期也是猪、鱼的优良饲料。除四季给家禽提供青饲料外，也可调制成干草或青贮料备用[1-5]。此外，还可以制备成气体、固体和液体等能源产品，以替代化石能源能减少温室气体的增长、减少碳的排放并消除烟雾，使环境和相关能源问题得以解决[6]。研究结果表明，象草用于重金属镉污染的土壤的修复也有很好的效果，修复效率甚至超过了镉超富集植物三叶鬼针草[7]。

有研究发现，植物基因组DNA上有一段称为核糖体基因DNA转录间隔区（Internal transcribed spacer，ITS）的序列，可以作为物种分类鉴定的条形码，Chen等[8]研究了超过4 000种植物的样品后发现，ITS2序列的物种鉴别成功率大于92.7%。目前有关象草的ITS2序列鲜有报道，在本试验中，拟提取其基因组DNA，克隆其ITS2序列，并进行序列的比较分析，提供相应信息，为今后的进一步研究打下基础。

1    材料与方法

1.1    试验材料

象草叶片。

1.2    試验方法

1.2.1    引物序列。上游引物序列为ATGCGATACTTG-GTGTGAAT，下游引物序列为GACGCTTCTCCAGAC-TACAAT。

1.2.2    ITS2序列的克隆与测序。首先从象草叶片提取基因组DNA，然后用上述引物进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后，将PCR产物送南京擎科生物技术有限公司测序。

1.2.3    序列分析。登录NCBI网站获取所需要的ITS2序列，用Lasergene 7.1的子软件SeqMan分析各种生态型象草ITS2序列的变异，用Clustalx 1.83和MEGA 6软件构建系统进化树。

2    结果与分析

2.1    象草ITS2序列的获得

用1.2所述的引物以象草葉片DNA为模板进行了PCR扩增，然后对PCR产物测序，得到了一段长度为283 bp的序列，包含部分5.8S序列、完全的ITS2序列和部分26S序列，具体序列已经提交GenBank，序列ID（Accession number）号码为MT649904。

2.2    不同物种间ITS2序列的系统发育分析

将所获得的象草ITS2序列和其他一些物种的ITS2序列用Clustalx 1.83和MEGA 6软件邻接法（NJ法）构建系统进化树，结果见图1。

从图1可以看出，明显可以分为3个聚类，象草（Pennisetum purpureum，MT649904）、荸荠（Eleocharis dulcis，AF190604）、姜（Zingiber officinale，LS999889）、美人蕉（Canna indica，FJ939544）、玉米（Zea mays，AF-019817）、小麦（Triticum aestivum，AJ301799）、水稻（Or-yza sativa，AF169230）聚为一类，此类几个物种均为单子叶植物，其中与玉米关系最为密切;陆地棉（Gossy-pium hirsutum，KF454241）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，LC089989）、红景天（Rhodiola rosea，KF454616）、大豆（Glycine max，MG237487）、圆叶葡萄（Vitis rotundifolia，MG200158）、水烛（Typha angustifolia，KF454377）、蒲公英（Taraxacum mongolicum，EF114672）、马齿苋（Portu-laca oleracea，AB823847）聚为一类，此类中除了水烛为单子叶植物外，其他均为双子叶植物;胡椒（Piper nigrum，LC461757）、银杏（Ginkgo biloba，Y16892）、马尾松（Pinus massoniana，JF829706）、云南红豆杉（Taxus wallichiana，MF785718）聚为一类，此类除了胡椒属于被子植物外，其余均为裸子植物。

2.3    象草不同生态型ITS2序列的比较分析

将获得的象草ITS2序列与从GenBank搜寻到的18个其他生态型象草的ITS2序列用Lasergene的子软件SeqMan进行碱基变异分析，发现ITS2区域的碱基位置能一一对应。不同研究者提交的19个ITS2序列如果被当成同一次实验的多个克隆的测序结果，可以拼接成一个“基准”ITS2序列，与“基准”ITS2序列比较，各个ITS2序列在对应位置的碱基不变或者变异成其他的碱基。

本文以MT649904序列为参照，则“基准”ITS2序列相对应的位置在第52碱基到第268碱基之间。由表1可知，MT649904、JX156340、JX156338、JX156339、KR350689、AF345232、AY628128、KJ776736这8个序列的ITS2区域内的序列与“基准”ITS2序列相比较，没有发生任何变化;其他11个序列的ITS2区域内的序列与“基准”ITS2序列相比较，出现1～5个碱基的变异，其中以FJ626356的变异最多，有5个位置的碱基发生了变异。多个来源的序列一起比较碱基发生变异的位置，则分别为第86、94、99、110、130、136、137、181、204、214、246碱基。发生变异最多的为第204碱基的位置，有5个序列发生了变异;其次为第181和第246碱基的位置，有4个序列发生了变异。

3    结论与讨论

从构建的系统进化树可以看出，象草的分类地位处于单子叶植物类别，与玉米关系密切，暗示了其为C4植物，具有高光合效率的特点。各个物种ITS2序列的聚类特点与分类地位基本吻合，表明用ITS2序列进行物种分类鉴定具有较高的正确性。

随着GenBank中的ITS2序列数据的不断增加，对一些物种而言，已经积累了很多的序列信息，但是经常发现，同一个物种的多条ITS2序列往往不完全一样，出现这种情况的原因可能是测序错误，也可能不同生态型发生了少量变异。以ITS2序列为参照，进行物种鉴别和系统进化树分析时，如果随机选择其中一条序列，大多数情况下问题不大，但有时可能出现偏差，因而更稳妥的办法是选择一条能够代表该物种的ITS2序列。采用“基准”ITS2序列，显然是一个解决办法。今后建立的ITS2序列数据库，当一个物种的ITS2序列信息积累到足够数量时，可以专门增列一条“基准”ITS2序列。如果要依靠手工获取“基准”ITS2序列，可以采用Lasergene的子软件SeqMan或其他软件，从GenBank获得一个物种的多条ITS2序列则往往要逐条搜索和下载，今后需要加强生物信息学软件的研制，以进一步提高效率。

4    参考文献

[1] 易显凤，赖志强.南方优质象草品种比较试验初报[J].广西大学学报（自然科学版），2008，33（3）：313-316.

[2] 孙鏖，邓荟芬，李彩军，等.南方三种暖季型牧草品种的比较研究[J].家畜生态学报，2013，34（2）：58-60.

[3] 吴能义，王兰，陈福海，等.3种热带牧草品种比较研究初报[J].中国热带农业，2019（6）：74-76.

[4] 滕少花，李冬郁.台湾甜象草与桂牧 1号杂交象草生产性能比较的观察 [J].广西畜牧兽医，2007，23（6）：243- 244.

[5] 滕少花，李冬郁，姚娜，等.台湾甜象草新品种高产栽培技术与利用试验[J].广西畜牧兽医，2012，28（3）：131-133.

[6] 雷学军.速生草本植物替代化石能源降碳除霾技术研究[J].环境工程，2014（8）：151-156.

[7] 覃建军，唐盛爽，蒋凯，等.象草在南方典型母质土壤中的镉修复效应[J].水土保持学报，2020，34（2）：372-377.

[8] CHEN S L，YAO H，HAN J P，et al.Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species[J].PLoS One，2010，5：370-375.

基金项目   国家自然科学基金资助项目（31400567）。

作者简介   蔡升（1993—），女，江苏南京人，在读博士研究生。研究方向：作物遗传育种与种质资源评价利用。

通信作者

收稿日期   2020-06-27