IL-17和IL-38在三阴性乳腺癌中的表达及意义

巫姜 叶骉飞 孟庆杰

[摘要] 目的 檢测IL-17和IL-38在TNBC患者中的表达，并探讨他们在其发病中可能存在的作用。 方法 选择2017年11月—2019年3月空军军医大学第一附属医院就诊的71例乳腺癌患者为研究对象，其中三阴性乳腺癌（TNBC）组36例，导管原位癌（DCIS）组35例，选取同期就诊的33例纤维腺瘤患者为对照组。Real-time RT-PCR检测组织标本中白细胞介素（IL）-17 mRNA和IL-38 mRNA的表达;免疫组化法检测组织标本中IL-17和IL-38蛋白的表达;并进一步分析TNBC组IL-17 mRNA和IL-38 mRNA表达的相关性。 结果 TNBC组和DCIS组IL-17 mRNA表达高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）;TNBC组和DCIS组IL-38 mRNA表达均低于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。TNBC组IL-17蛋白阳性表达强于DCIS组及对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。TNBC组和DCIS组IL-38蛋白阳性表达弱于对照组，差异有统计学意义（均P < 0.05）。TNBC患者IL-17 mRNA与IL-38 mRNA的相对表达量呈负相关（r = -0.685，P < 0.01）。 结论 IL-17在TNBC中表达增高，IL-38则表达降低，IL-17 mRNA与IL-38 mRNA的表达呈负相关关系，他们在TNBC发病过程中可能起相反的作用。

[关键词] 白细胞介素-17;白细胞介素-38;三阴性乳腺癌;乳腺癌

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）10（b）-0085-05

[Abstract] Objective To detect the expression of IL-17 and IL-38 in triple negative breast cancer （TNBC） patients， and to explore their possible role in the pathogenesis of breast cancer. Methods From November 2017 to March 2019， 71 cases with breast cancer admitted to Xijing Hospital （“our hospital”for short） were selected as study subjects， including 36 cases in the TNBC group and 35 cases in the ductal carcinoma in situ （DCIS） group， and 33 patients with fibroadenoma who admitted to our hospital at the same time were selected as the control group. The expression of interleukin （IL-17） mRNA and IL-38 mRNA in tissue samples were detected by real-time RT-PCR; and the protein expression of IL-17 and IL-38 were detected by immunohistochemistry. The correlation between IL-17 mRNA expression and IL-38 mRNA expression in the TNBC group was further analyzed. Results The expression IL-17 mRNA in TNBC group and DCIS group were higher than those in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. While the expression of IL-38 mRNA in TNBC group and DCIS group were lower than those in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. The protein positive expression of IL-17 in TNBC group was higher than that in DCIS group and control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. While the protein positive expression of IL-38 in TNBC group and DCIS group were lower than those in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. The relative expression of IL-17 mRNA and IL-38 mRNA was negatively correlated in TNBC（r = -0.685， P < 0.01）. Conclusion The expression of IL-17 is increased and IL-38 is decreased in TNBC. There is a negative correlation between IL-17 mRNA and IL-38 mRNA. They may play an opposite role in the pathogenesis of TNBC.

[Key words] Interleukin-17; Interleukin-38; Triple negative breast cancer; Breast cancer

2019年的一项最新研究结果显示[1]，乳腺癌为美国女性中最常见的癌症之一，是继肺癌之后第二大致女性死亡的癌症。三阴性乳腺癌（TNBC）具有独特的临床表现，如发病年龄更轻、生存期更短、恶性程度更高、复发转移及死亡率更高等特点[2-3]，其发病率占乳腺癌总数的15%～20%[4]。王国庆等[5]发现人类乳腺癌肿瘤中存在白细胞介素（IL）-17的表达。IL-17R敲除和IL-17/γ-干扰素（γ-IFN）双敲的小鼠具有抑制肿瘤生长的能力[6]，提示IL-17具有促进肿瘤的作用。IL-38及其受体IL-36R mRNA在结直肠癌组织中高表达，且呈正相关，提示其参与结直肠癌的发生、发展[7]，也与炎症及肺癌的发生、发展和预后有关[8-9]。

目前IL-17在TNBC发病过程中的具体机制尚不清楚，而IL-38在乳腺癌中报道甚少，本研究旨在检测TNBC组织中二者的表达情况，初步探明他们在TNBC发病中可能存在的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年11月—2019年3月空军军医大学第一附属医院（以下简称“我院”）就诊的71例乳腺癌患者为研究对象。其中TNBC组36例，年龄26～58岁，平均（47.00±12.68）岁;导管原位癌（DCIS）组35例，年龄29～54岁，平均（41.00±14.27）岁。选取同期于我院就诊的33例纤维腺瘤患者为对照组，年龄24～53岁，平均（36.00±13.38）岁。本研究经我院医学伦理委员会批准，征得受试者同意并签署知情同意书。三组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：①病理确诊为TNBC、DCIS及纤维腺瘤;②初次诊治;③女性患者。排除标准：①入组前已行放化疗及免疫治疗者;②实验期间出现重度感染者;③因其他因素使用免疫抑制/调节剂者;④伴自身免疫性疾病、免疫缺陷病及其他恶性肿瘤者。

1.3 主要试剂与仪器

Trizol（Thermo Fisher，IS10007）;SYBR GreenⅠRealtime PCR Master Mix（Sino Biological，E090）;反转录试剂盒（Takara Bio，RR037A）;DEPC（Thermo Fisher，1210019），PCR产物纯化试剂盒（北京TIANGEN，DP214-02）;兔抗人多克隆抗体一抗工作液：IL-17（Abcom，ab9565）和IL-38（Santa-Cruz，QYA04878）;羊抗兔二抗（Abcom，ab97051）;DAB染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9019）。

超低温高速离心机（Thermo Fisher，sorvall stratos）;核酸蛋白测定仪（Thermo Fisher，NanoDrop1000）;PCR仪（BIO-RAD，C1000TM）;Real-time RT-qPCR仪（BIO-RAD，7900HT）;蛋白电泳仪（Thermo Fisher，NanoDropOneC）;凝膠成像仪（Thermo Fisher，E-Gel Imager）。

1.4 方法

1.4.1 标本采集及处理  超声引导粗针穿刺或手术过程中取肿瘤组织或纤维腺瘤瘤旁正常腺体，一分为二，一份迅速液氮冷冻后转至超低温冰箱中保存，另一份于10%甲醛溶液固定。

1.4.2 Real-time RT-PCR检测IL-17 mRNA和IL-38 mRNA表达  在防RNA酶污染的条件下采用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，分别检测IL-17和IL-38的表达，引物由大连TaKaRa公司设计合成，引物序列见表1。反应体系：SYBR GreenⅠ染料10 μL、上下游引物各1 μL、dNTP 1μL、Taq聚合酶2 μL、IL-17或IL-38 cDNA 5 μL、ddH2O 30 μL，总体积 50 μL。反应条件为：预变性95.0℃ 5 min，变性95.0℃ 15 s，退火30 s，IL-17、IL-38和β-actin退火温度分别72.2℃、67.6℃和53.9℃，分别为40和42个循环。以β-actin作为内参进行数据分析[7，11]。采用2-ΔCt进行相对定量，Ct值为荧光信号达到设定阈值所经历的循环数，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（管家基因）。

1.4.3 免疫组化检测IL-17和IL-38蛋白的表达  取福尔马林固定好的组织标本，石蜡包埋组织，完成切片，分别进行IL-17和IL-38免疫组化染色[12]。本研究同时设置阴性和阳性对照。由两位经验丰富的病理学高年资医生采取双盲法在400倍镜下随机选择5个不重复的视野，IL-17和IL-38蛋白的表达阳性时细胞浆和/或细胞膜被染成棕黄色或黄色，记录免疫组化染色深度（0分为阴性，1分弱阳性，2分中等强度阳性，3分为强阳性）和面积（0分：<5%，1分：5%～25%，2分：>25%～50%，3分：>50%～75%，4分：>75%）。将染色深度和面积赋分的乘积大于1分者定义为阳性[12]。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验;相关性采用Pearson相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组IL-17 mRNA表达比较

TNBC组和DCIS组IL-17 mRNA表达高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。TNBC组与DCIS组IL-17 mRNA表达比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1、表2。

3 讨论

乳腺癌的发病率从20世纪80年代开始在全球及我国均呈上升趋势[13-14]。虽其病因尚不清楚，但已明确其发病存在一定的规律性，且不同分子分型的乳腺癌具有不同的临床特点、危险因素及预后特点，其中TNBC对广大女性生命健康的危害与其他亚型有较大的差异[15]。目前研究TNBC的发病、转移、耐药等仍然是热点[16]。

IL-17主要是由Th17细胞产生的促炎性细胞因子，具有多种生物学效应，具有强大的招募中性粒细胞作用，并能促进多种细胞因子的释放，在乳腺癌的发病过程中起着重要的作用[17]。同时，IL-17在非小细胞性肺癌、胃癌、结肠癌及卵巢癌等许多肿瘤性疾病中都有表达[12，17-18]。IL-17R敲除小鼠和IL-17/IFN-γ双敲小鼠抑制肿瘤生长[6]，提示IL-17具有促进肿瘤生长作用;Chen等[19]研究显示，乳腺癌肿瘤微环境中能够产生IL-17的细胞增多成为乳腺癌预后不良的因素。IL-38與多种炎性疾病密切相关，能与IL-36R结合，抑制念球菌诱导的IL-22和IL-17的产生，进而发挥抗炎作用，在类风湿关节炎的发病中发挥作用[20-22]。

本研究结果显示，TNBC组和DCIS组IL-17 mRNA表达高于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）;而TNBC组和DCIS组IL-38 mRNA表达低于对照组（均P < 0.05）。TNBC组IL-17蛋白阳性表达高于DCIS组和对照组，而TNBC组、DCIS组IL-38蛋白阳性表达低于对照组（均P < 0.05）。提示IL-17及IL-38可能参与TNBC的发生。张黎等[23]研究显示乳腺癌患者术前血清IL-38含量显著低于健康女性，但术后却明显高于术前;术前IL-22和IL-17显著高于健康女性，术后则显著降低;进一步研究显示，IL-38能抑制乳腺癌细胞MCF-7的活力、促进其凋亡，而IL-22和IL-17则起着促进作用。这些可能是通过调控增殖细胞核抗原（PCNA）、凋亡促进基因（bax）和B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）等途径实现的[23]。类风湿关节炎患者血清IL-38及IL-17呈负相关[22]，IL-38能够通过抑制IL-17和IL-22的产生，发挥抗炎作用[7]。本研究显示TNBC患者IL-17 mRNA与IL-38 mRNA的相对表达量呈负相关（P < 0.01）。因此，TNBC中IL-38与IL-17发挥着相反的作用。

综上所述，IL-17和IL-38在多种炎性疾病及乳腺癌等多种肿瘤疾病中都有参与。本研究显示，IL-17及IL-38可能参与了TNBC的发生发展，且二者呈负相关。因此，IL-17及IL-38有望成为TNBC研究的新靶点，但其确切机制仍需更深入的研究与探讨得以明确。

[参考文献]

[1]  DeSantis CE，Ma J，Gaudet MM，et al. Breast Cancer Statistics，2019 [J]. CA Cancer J Clin，2019，69（6）：438-451.

[2]  Chen W，Zheng R，Baade PD，et al. Cancer statitics in China，2015 [J]. CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[3]  Escórcio-Dourado CS，Martins LM，Simpl cio-Revoredo CM，et al. Bcl-2 antigen expression in luminal A and triple-negative breast cancer [J]. Med Oncol，2017，34（9）：161.

[4]  Khosravi-Shahi P，Cabezón-Gutiérrez L，Custodio-Cabello S. Metastatic triple negative breast cancer：Optimizing treatment options，new and emerging targeted therapies [J]. Asia Pac J Clin Oncol，2018，14（1）：32-39.

[5]  王国庆，刘燕，高鸿霞.IL-17A在乳腺浸润性导管癌中表达及对MCF-7细胞增殖转移的作用[J].北华大学学报：自然科学版，2018，19（5）：616-618.

[6]  He D，Li H，Yusuf N，et al. IL-17 promotes tumor development through the induction of tumor promoting microenvironments at tumor sites and myeloid-derived suppressor cells [J]. J Immunol，2010，184（5）：2281-2288.

[7]  张瑜，金建军，田笑笑.IL-38及其受体IL-36R mRNA在结直肠癌中的表达及意义[J].胃肠病学和肝病学杂志，2018，27（12）：1383-1385.

[8]  Takada K，Okamoto T，Tominaga M，et al. Clinical implications of the novel cytokine IL-38 expressed in lung adenocarcinoma：Possible association with PD-L1 expression [J]. PLoS One，2017，12（7）：e0181598.