李晓成：“非瘟”防控两大关键技术之实验室检测

在非洲猪瘟的整个防控工作当中，不管是早期预警，早期发现，疑似病确诊， 还是环境评估都离不开实验室检测， 尤其是随着非洲猪瘟在我们国家的进一步发展， 在临床上， 非洲猪瘟的临床症状多样性越来越明显， 我们通过临床观察很难确诊疾病， 所以非瘟的诊断和防控都必须依靠实验室检测技术， 对此我们需要对影响实验室诊断的一些因素必须有个清醒的认识。

1 影响实验室准确检测的因素

1.1 样品的代表性

如果采的唾液样本， 仍用生理盐水和PBS 缓冲液， 会很难保证样品的可靠性， 必须加一些有效的酶抑制剂， 才能有效保持唾液样本的活性， 建议选用特定的保存液用于唾液样品的采集及保存。

1.2 样品的运输条件及保存时间

有人针对样品的保存时间做过很多实验， 结果发现保存7 天之内进行临床检测是比较有意义的。

1.3 样品处理

在我们现有的已经注册和批准使用的试剂盒当中， 一般情况下不包含核酸提取试剂盒， 但是有人做过很多实验， 不同公司提供的核酸提取试剂盒差异非常大， 提取的质量差异也很大， 即使是病毒含量很高的一些样品， 最终结果也能出现一些差异性结果。

1.4 PCR 试剂盒

现阶段使用最多的是荧光定量PCR 试剂盒， 但随着非瘟的进一步发展，防控能力不断提升，越来越多的试剂盒会出现在我们大家的手中，如胶体金试剂盒、试纸条、免提试剂盒，还有其他一些试剂盒。 每一种试剂盒的使用范围，样品种类，灵敏度，最低检测限等是不一致的。

所以我们一定要注意试剂盒的最低检测限， 需要清楚知道我们使用试剂盒的检测目的， 有目的性的选择试剂盒。

1.5 实验室操作人员

实验室操作人员在整个检测过程当中是非常重要的一个环节。 因为非瘟的缘故， 很多企业或者猪场新建了实验室， 有些实验室人员的素质非常高， 但是有些实验室的人员素质还是不尽如人意， 需要进行培训。

1.6 实验室环境

实验室环境是容易造成污染的， 所以说实验室环境应该要想办法尽可能去清除污染。

1.7 PCR 仪器

有一个大家以前没有关注到的地方——PCR 仪器， 原先我们认为所有的试剂盒， 所有的PCR 仪器都可以适应。 但是经过很多精细化的检测壁垒实验以后， 有很多试剂盒对有些PCR 仪器是不适用的， 所以说在PCR 仪器的选择方面， 我们需要做一定的工作。

2 实验室检测一定要明确检测目的

检测目的会直接要求对样品种类和混样比例做出明确的规定

2.1 监测预警

口腔和鼻腔拭子是首选样品，且混样比例不能过高， 一般规定不能超过10 个样。

为什么？ 因为猪在自然感染情况下，病毒最早出现在扁桃体，大概在3～6 天， 口腔和鼻腔出现这个病毒， 而且在早期口腔和鼻腔当中的病毒含量不会太高， 所以为了提高灵敏度，提高准确性，混样比例不宜过高。

2.2 准确诊断

口鼻拭子和抗凝血是最合适的样本，样本的混样比例可以加大。

准确诊断主要是用于临床，当临床上出现临床症状 （疑似病例）时，血液、口腔、鼻腔、组织当中病毒含量极其高， 用哪一个组织哪一个样本来检测都没有任何问题了，而且有人做过实验， 即使样品稀释到1∶2048，仍然能够检测到病原。

2.3 评估环境

环境评估判断舆情风险或进行复养最核心的一个技术环节。

在清洗和消毒之后环境样品中的病毒含量一般都极低， 如果混样比例高的话会影响检测结果， 建议一般情况下不主张超过10 个样品的混合，一般是限定在10 个样品以内。

检测目的可以决定提取试剂盒和PCR 试剂盒的选择。

监测预警及环境评估都要求核酸提取试剂盒、PCR 检测试剂盒里的灵敏度要高， 而准确诊断对试剂盒的选择无需那么严格， 一般试剂盒基本上都能满足要求， 比方说一些灵敏度不高的试剂盒， 一些免提取的试剂盒， 我们直接做抗凝血的检测，都没有什么问题。

可能最近一段时间， 有这样一种现象，买PCR 仪器赠送试剂盒， 有些甚至用很灵敏的一种发光试剂盒， 但这种试剂盒灵敏度很高，但是可靠性很差。 可靠性很差的最主要表现是什么？ 重复性很差，所以不主张用这种试剂盒， 建议首先选取已经正式注册， 有农业农村部发布文号的试剂盒。

3 检测结果的解读

试剂盒成立的条件是阴阳性对照，必须出正确的结果。 检测样品出阳性结果， 只能说是核酸阳性， 只代表病原的感染痕迹， 并不能说明它具有感染性或者我们所说的活性， 不能判断病原的活性。 但是检测核酸阴性结果， 最起码能说明我们对环境的清理、清洗、消毒起到了一定作用。 如果说环境当中仍然有核酸阳性， 尽管我们不能判断它是否有活性， 但是从另外一个方面反映，清理、清洗、消毒工作是不彻底的。