提高基层非洲猪瘟荧光PCR检测准确性的措施

童洪生 丘富安 李宝兰

（1.建宁县动物疫病预防控制中心 福建建宁 354500；2.福州中科基因有限公司 福州 350003；3.三明市动物疫病预防控制中心 福建三明 365000）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种猪的高度接触性烈性传染病，其发病率、病死率都很高；非洲猪瘟病毒属于DNA病毒，病毒粒子较大，基因型多，基因组变异频繁，病毒在环境中比较稳定。OIE将该病列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[1]。2018年8月，辽宁省沈阳市确诊我国首例非洲猪瘟，至今全国所有省份都已出现非洲猪瘟疫情[2]，对我国生猪产业带来重创，为做好非洲猪瘟防控工作，国家和各省市加大了对基层动物疫病防控基础设施建设投入的力度，大力推广病原学PCR实验室建设，委托各市、县（市、区）自行开展非洲猪瘟等检测工作；同时，农业农村部要求自2019年7月1日起，各屠宰场须自行开展非洲猪瘟检测工作。由于市级、县级和屠宰场实验室各方面条件（包括实验室检测环境条件、仪器设备条件、实验室检测人员等）参差不齐，因此，规范开展非洲猪瘟荧光PCR检测，提高检测结果的准确性和可信度，是当前工作中面临的重要任务。

1 完善实验室基础设施

1.1 实验室功能分区 荧光PCR试验应分区进行，实验室必须分隔为试剂准备、样品制备、核酸扩增和产物分析等三个独立工作区域。为防止核酸气溶胶对试验过程造成污染，避免试验之间的相互干扰，各工作区域之间应具备单向的气流、物流与人流，形成单向流程的保护屏障。

1.2 配备必要的仪器设备 荧光PCR实验室必须配备荧光PCR仪、低温离心机、核酸提取仪、生物安全柜、冰箱、移液器等主要仪器设备，并严格按照操作规程进行维护，保证其在规定参数内正常运行。

2 强化人员培训，实行专人专岗

2.1 人员资质 荧光PCR检测实验室必须配备具有畜牧兽医专业大专以上学历的专职检测人员1~2名，经相关的检测技术、生物安全培训，获得上岗资格后方可开展荧光PCR检测工作。

2.2 培训与考核 要制定并执行定期考核和培训制度，必要时派人参加更高级别的实验室培训和跟班学习，以提升检测人员的检测技能。省市要定期对开展非洲猪瘟荧光PCR检测实验室进行盲样比对考核。

3 做好样品和试剂的管控

3.1 样品的管控 在采样过程中要避免交叉污染；样本送达后应做好登记、编号，并存放于4℃冰箱或阴凉处，及时进行分离和制备，尽快进行检测；48 h内无法开展检测或需要留样的应储存于-20℃冰柜冷冻保存；送上级实验室进行检测的样品，应妥善包装后尽快冷藏寄送。

3.2 试剂的管控 采购的非洲猪瘟荧光PCR诊断试剂盒必须符合农业农村部的规定和要求，有相应的批准文号；要按试剂盒的要求妥善保存试剂，避免使用伪劣、过期或失效试剂。PCR反应液对温度敏感，每次使用时应置于冰上，用完后尽快冷冻保存，冻融次数不宜过多。

4 按规程开展检测

4.1 检测方法 荧光PCR实验室应优先按国家或行业标准规定的方法开展检测，非标准方法则需经过确认后方可使用，所有采用的检测方法要受控管理。不同厂家生产的非洲猪瘟病毒荧光PCR快速检测试剂盒，其检测方法略有不同，应严格按说明书的要求操作。

4.2 混样 非洲猪瘟检测工作任务非常繁重，成本较高。为适应基层大批量检测工作和降低检测费用的需要，对检测样品可以根据不同的对象和要求进行混样检测。可以采用5合1混样进行检测，一般不能超过10合1的比例。若混样比例过高，容易出现因被检样品核酸浓度小于最低检测限值，发生假阴性的结果。

4.3 样品的留存 用于猪瘟检测的样品，应根据不同的要求做好留样。屠宰场检测实验室应按规定对样品进行编号、留样，冷冻保存1个月。检测结果为疑似阳性的样品，如果需要留样的，应单独保存，并在样品复核和送检完成后对样品及时进行无害化处理。

4.4 阳性样品的复核 若样品在采集和制备过程中被污染，可能会出现假阳性的结果。检测结果出现疑似阳性的，有条件的实验室可以选择不同的试剂盒进行复核，结果一致的才能确定为阳性。如果是用混样进行检测，则需要用未经混样前的样品逐份进行检测，以确定阳性个体和阳性数量。必要时将疑似阳性样品送级别更高的实验室进行进一步诊断。

5 做好实验室生物安全

1）非洲猪瘟病毒在自然条件下可以长时间保持感染性，在感染猪分泌物和环境污染物中长期存活，在粪便内可存活160 d，在土壤中存活190 d[3]。为避免病毒通过污染的用具、废弃的物品进行传播，荧光PCR实验室要做好人员和物品进出的管控，废弃物品必须经过高压灭菌处理，不可随意丢弃。

2）荧光PCR试验完毕后，必须对实验室环境彻底消毒。生物安全柜和洁净工作台进行紫外照射消毒，时间不低于30 min，以破坏残留的核酸；工作台面等用10%次氯酸或75%酒精等消毒液消毒；实验室内的样本液和扩增产物是气溶胶的主要污染源，故实验室要经常换气和消毒；所有试验区域，包括悬挂白大褂位置、放置高速离心机位置、放置PCR仪等区域都要用可移动紫外线灯照射30 min。